1、順鉑對肺癌細胞耐藥基因表達水平的影響         11-03-25 09:13:00     作者：杜永杰    編輯：studa20【摘要】  研究順鉑（DDP）對肺癌細胞耐藥基因MRP1，MGMT，XPA和XPB表達水平的影響，探討不同耐藥機制在肺癌耐藥過程中的作用。方法： 以噻唑藍還原法（MTT）檢測DDP對肺癌細胞A549生存率的影響，實時熒光定量PCR技術檢測DDP處理前后肺癌細胞MRP1，MGMT，XPA和XP

2、B mRNA的表達水平。結果： 不同濃度DDP（1.2540 g/ml）處理肺癌細胞48 h，細胞的生存率從74.7%降至17.4%。4 g/ml DDP處理肺癌細胞12, 24和48 h后，細胞生存率分別為96.1%,73%和48.5%。DDP處理引起細胞的MRP1 mRNA表達水平先下降后上升；MGMT mRNA表達水平下降；XPB和XPA mRNA表達水平均增高。結論： DDP可以導致肺癌細胞耐藥基因MRP1，MGMT，XPA和XPB mRNA表達水平的改變，提示多種耐藥機制參與了DDP引起的肺癌細胞耐藥。 【關鍵詞】  肺癌 順鉑 耐藥 MRP1 MGMT XPA XPB&#

3、160;   Abstract  Objective: To study the effect of cisplatin (DDP)on expression levels of drug resistance associated genes MRP1,MGMT,XPA,XPB in lung cancer cells, and explore the effect of different mechanisms in drug resistance of lung cancer cell.Methods： Cell survival rate was meas

4、ured using MTT metabolic viability assay.The levels of genes expression was measured by real time fluorescent quantitative PCR assay. Results： The cell survival rate decreased from 74.7% to 17.4% after 48 h treatment of DDP ranging concentration of 1.2540 g/ml.The cell survival rate decreased to 96.

5、1%,73%,48.5% respectively after 12, 24, 48 h treatment with 4 g/ml of DDP.The level of MRP1 mRNA expression increased after the first drop; MGMT mRNA expression levels drop; XPB and XPA mRNA expression levels both increased in these cells treated with DDP. Conclusion： DDP could lead to the expressio

6、n levels change of MRP1, MGMT, XPA, XPB mRNA in lung cancer cell.The results indicated that varieties drug resistant mechanisms are associated with drug resistant mechanisms developing of lung cancer.    Key words  lung cancer;  cisplatin;  drug resistance;  MRP1；

7、MGMT； XPA； XPB    近年來，雖然肺癌化療效果隨著新藥的問世有了一定程度改善，但總的效率仍不理想。這與藥物的抗癌作用選擇性差,腫瘤的多藥耐藥（multidrug resistance, MDR）以及患者的個體差異有關。其中，MDR是導致化療失敗的重要原因。腫瘤細胞的耐藥性涉及細胞的多種生化改變，包括膜蛋白介導的耐藥機制、酶修復機制、核苷酸切除修復（nucleotide excision repair, NER）機制等，研究肺癌細胞的耐藥機制對于尋找新的治療對策有著至關重要的作用1。本研究采用實時熒光定量PCR技術檢測肺癌細胞經順鉑（cisplatin

8、，DDP）處理后上述三種耐藥機制中相關基因的表達水平，探討不同耐藥機制在肺癌發生過程中的作用。這些基因分別是：參與膜蛋白介導耐藥機制的多藥耐藥蛋白1（multidrug resistance protein 1,MRP1）基因，酶修復機制中的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶（O6methylguanine methytransferase, MGMT）基因，NER機制中的著色性干皮病A (xerodema pigmentosum group A, XPA)和著色性干皮病B(xerodema pigmentosum group B，XPB)基因。    1

9、0; 材料與方法    1.1  主要試劑與儀器    DMEM培養基（Gibco公司），新生牛血清（甘肅蘭州民海生物工程有限公司），DDP（山東德州德藥有限公司），噻唑藍（Amresco公司），二甲亞砜（Amresco公司），Trizol試劑盒（Invitrogen公司），ReverAid試劑盒（Mbi公司），實時PCR 試劑盒（Toyobo公司）。倒置式生物顯微鏡（TE300，Nikon），酶標儀(BioTek公司)。熒光定量PCR分析儀（Stratagene Mx3000P）。肺癌細胞A549由江蘇大學生命科學院提供。

10、    1.2  細胞處理    取處于對數生長期的A549細胞，胰酶消化后充分吹打成單細胞懸液，計數。用培養基調整其濃度至1×105/ml,每次取100 l 接種至96孔板，貼壁過夜。DDP用DMEM培養液配置。劑量效應：設6個劑量組（DDP終濃度分別為1.25, 2.5, 5, 10,20,40 g/ml）和對照組，DDP處理48 h，MTT法檢測細胞生存率。時間效應：設4個點,為細胞處理前和經4 g/ml DDP處理后12，24，48 h, MTT法檢測細胞生存率。并采用實時熒光定量PCR測定MRP1，MGM

11、T，XPA和XPB mRNA表達水平。    1.3  MTT法檢測DDP對細胞生存率的影響    細胞經相應處理后，每孔加入5 mg/ml MTT 20  l，培養4 h。吸盡培養液，加入二甲亞砜150 l/孔，震蕩10 min，酶標儀測定570 nm處D值。每組設10個復孔，計算平均值。細胞的生存率=（實驗組細胞D值/對照組細胞D值）×100% 。    1.4  熒光實時定量PCR    細胞處理結束后，用Trizol試劑提取細胞

12、總RNA，經紫外分光光度儀檢測總RNA的濃度后，用ReverAid試劑盒反轉錄獲得cDNA，最后選用實時PCR 試劑盒在熒光定量PCR儀上進行實時熒光定量PCR。引物應用Primer 5.0軟件設計，引物序列：actin：上游引物5ACACTGTGCCCATCTACGAGG3,下游引物5AGGGGCCGGACTCGTCATACT3，產物長度250 bp； MRP1：上游引物5GCAGAACTTTCAGCCAGTGAACAA3,下游引物5ACAATACCAGCCGGGTCAAGAG3，產物長度256 bp；MGMT：上游引物5TCGCTCCATGAATGGCAAGATA3,下游引物5TTCCAT

13、GGGAGCCTGGATGTA3，產物長度211 bp；XPA：上游引物5GCTACTGGAGGCATGGCTAAT3,下游引物5GTTGGCAAATCAAAGTGGTTC3，產物長度212 bp；XPB：上游引物5GCTACATCGCCAAAGTCCAG3,下游引物5CGTAGATATAGGGTTTGTTCAGTCA3，產物長度246 bp。引物由上海英駿生物技術公司合成。    反轉錄體系總體積為20 l，包括總RNA 1 g，Oligo(dT)18 1  l，5×反應緩沖液4  l，10 mmol/L dNTP 2 l，RNA酶

14、抑制劑 1 l，MMuLV反轉錄酶 1 l（按說明書操作）。PCR體系總體積為20  l，包含cDNA 1 l，Master Mix 10 l，1 mol上下游引物各1 l，雙蒸水補足體系。擴增條件：95 5 min預變性，95變性30 s，62 退火30 s，72 延伸30 s，40個循環后制作熔解曲線。以actin作為內參照，定量分析MRP1，MGMT,XPA和XPB mRNA的相對表達水平。    1.5  統計學處理    DDP處理肺癌細胞后生存率變化分析采用秩相關分析，DDP處理肺癌細胞前后4種基因mR

15、NA表達水平變化的比較采用秩和檢驗中的F檢驗，用SPSS13.0統計軟件包進行數據相關分析。    2  結  果    2.1  肺癌細胞生存率的變化    2.2  耐藥相關基因的表達水平    肺癌細胞A549接觸DDP后，MRP mRNA表達水平先降低后增高；MGMT mRNA表達水平下降；XPA和XPB mRNA表達均增高。肺癌細胞A549接觸DDP 48 h時，MRP1，XPA和XPB mRNA表達的增高有統計學意義。這4種

16、基因mRNA表達均有隨DDP處理時間延長而增加的趨勢（表1）。表1  DDP（4 g/ml）處理前后耐藥相關基因的表達水平    2.3  實時熒光定量PCR擴增耐藥相關基因     如圖1所示在相同條件下各耐藥基因進行PCR反應的同時實時采集熒光數據得出的擴增曲線，圖中的水平直線為5種基因共同達到的熒光閾值，其對應的橫坐標即為各基因的循環次數。為檢驗各基因PCR產物的特異性，在擴增反應結束后制作熔解曲線，如圖2所示各基因的熔解曲線均呈單峰，且波峰所對應的橫坐標均大于80，說明各產物應該是PCR產物,不存

17、在非特異性的擴增產物。    3  討  論    DDP為金屬鉑的化合物，含有類似烷化劑的雙功能基團，與細胞內親核基團結合，主要作用靶點為DNA，作用于DNA鏈間及鏈內交鏈，形成DDP-DNA復合物，抑制DNA復制和轉錄，導致DNA斷裂和錯誤編碼，造成細胞死亡，DDP屬周期非特異性藥1。荷蘭研究者選取27例接受DDP方案化療的肺癌患者為研究對象，并用棉拭子取其頰黏膜細胞，采用免疫組織化學法，檢測紡錘絲結合蛋白表達，以此間接測定DDP-DNA表達,結果發現，DDP-DNA高表達者達14例，且DDP-DNA高表達者中位生存期較低表達者明顯延長，說明DDP可以通過作用于細胞DNA,進而抑制腫瘤生長，延長患者生存期2。    由膜轉運蛋白介導的耐藥是迄今研究最為廣泛的一種腫瘤細胞耐藥機制，該機制通過細胞膜上的蛋白將藥物從細胞內泵出，減少腫瘤細胞內抗腫瘤藥物的積累和滯留，使藥物濃度低