1、生物技術 實驗報告水稻愈傷組織的誘導一、實驗目的1、掌握外植體的消毒方法和接種技術；2、了解愈傷組織誘導的過程。二、實驗原理以植物器官、組織、細胞等作外植體進行離體培養時，在一定的誘導培養條件下都能誘導形成愈傷組織。愈傷再經分化培養，通過器官發生途徑或體細胞胚胎發生途徑可再生成植株。外植體源自自然環境均為帶菌狀態，在接種前都必須進行消毒。對于難消毒的材料，有時要幾種消毒劑配合使用；對于多茸毛表面粗糙不平的材料，要加展著劑（吐溫20）以增強消毒效果。三、實驗材料與用具1、材料：水稻成熟種子（用于誘導愈傷組織）；2、試劑：75%酒精，2% NaCLO，無菌水(每組1瓶400mL)；3、培養基：誘導

2、培養基：NB+2,4-D 2mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂8g/L（pH5.8）；4、儀器設備：培養室、超凈工作臺、培養皿（9cm）2個、槍形鑷、量筒（100mL）2個、三角瓶（50mL、無菌）2個、廢液缸、保鮮膜、標簽紙。四、實驗步驟1、接種室、培養基及用具表面消毒 用75%酒精棉球試擦超凈工作臺、鑷子，將培養基及用具放工作臺，打開紫外燈，照射20分鐘以表面消毒。之后關紫外燈，打開工作臺風機，通風30分鐘后可進行無菌操作。2、種子去殼選取飽滿、無霉變、成熟的水稻種子，手工脫去谷殼（注意保持胚完整），每人準備30粒去殼種子，并按照分組放到三角瓶中。3、操作者雙手的清洗與消毒在進入無菌室之前，各

3、操作者先用自來水清洗干凈雙手并晾干，然后進入無菌室，坐在超凈臺前位子上后，用含75%酒精的酒精噴壺噴灑雙手對雙手進行消毒，在超凈臺風口待雙手酒精風干后進入超凈工作臺。（注意：酒精噴壺噴灑雙手時切記不要把酒精噴到超凈臺的有機玻璃板上！）4、超凈臺面的表面消毒（以下工作在超凈工作臺內進行）用槍形鑷子從含75%酒精棉球的容器中取一團棉球，仔細把整個超凈臺面擦試一遍，盡量降低超凈臺面的帶菌量，并將廢棉球丟到廢液缸中，然后點亮超凈臺里面放置的酒精燈。5、外植體消毒（分組操作，每組由一位代表操作完成外植體的消毒工作）將脫谷殼米粒轉到一50mL無菌三角瓶加適量無菌水洗一次（以沒過種子為準，下同）棄水，倒入7

4、5%酒精適量，搖動攪拌，放置30秒（過程中適當輕搖動混勻）棄酒精加適量無菌水洗一次棄水倒入適量2% NaCLO，不時搖動攪拌，共處理30分鐘棄NaCLO用無菌水洗3次，每次停留1分鐘倒去無菌水，將種子從三角瓶轉到帶無菌濾紙的無菌培養皿中吸干。6、接種與觀察將吸干的消毒種子用無菌的鑷子接入培養基并均勻放置，每皿接10粒，每人共接種2皿。接種完成后，將培養皿蓋上并用保鮮膜封口，然后將接種有材料的培養皿移出超凈臺，貼上標簽寫明日期、接種人，按照班級統一放入一籃子，再將籃子放入培養室進行25暗培養。注意每隔2-3天前來觀察一次實驗現象，1周后調查計算污染率，14天后調查計算愈傷組織誘導率。接種的總種子

5、數 污染率(%)= ×100%污染的種子數接種的總種子數誘導率 (%)=×100 ×100%形成愈傷組織的種子數數組誘導率 (%)=織的誘導 五、實驗結果本次實驗我組未出現被污染的種子，污染率均為0 。說明實驗過程中，我組成員操作規范，保證所接種的種子均不受到污染。 最后，我組的2個培養皿分別可以誘導出7和8株水稻苗，誘導率分別為70%和80% 。六、 討論與分析1、 本實驗出現污染的原因分析。1） 外植體消毒不徹底，表面有較多微生物殘留；2） 實驗用具如鑷子等消毒不徹底，在操作過程中把微生物帶到種子上，污染種子；3） 實驗前，超凈工作臺沒有充分消毒，臺內（主要是空氣中）還殘留有較多微生物；4） 培養皿密封措施做得不好，致使培養期間有微生物進入到培養皿中，并生長繁殖。2、 降低實驗中的污染率的方法。1） 外植體、實驗用具、超凈工作臺均需徹底消毒；2） 做好密封措施；3） 操作時勿離酒精燈太遠；4） 盡量縮短操作時間；5） 定時更換消毒液（75%酒精、