1、x x x x x 公 司食品中大腸菌群計數測定的標準操作規程編號起草人日期審核人日期批準人日期實施日期第版文件密級1目的規范食品中大腸菌群計數測定的標準操作規程。2范圍本標準規定了食品中大腸菌群（Coliforms ）計數的方法。本標準適用于食品中大腸菌群的計數。3術語和定義大腸菌群coliforms在一定培養條件下能發酵乳糖、產酸產氣的需氧和兼性厭氧革蘭氏陰性無芽胞桿菌。最可能數 most probable number ，MPN基于泊松分布的一種間接計數方法。4責任質量部組織制訂、化驗室負責實施。5內容設備和材料除微生物實驗室常規滅菌及培養設備外，其他設備和材料如下:恒溫培養箱：36 C

2、± 1 Eo冰箱：2 E5 Eo恒溫水浴箱：46 E± 1 Eo天平：感量g o均質器。振蕩器。無菌吸管：1 mL （具mL刻度）、10 mL （具mL刻度）或微量移液器及吸頭。無菌錐形瓶：容量500 mLo無菌培養皿：直徑90 mmpH 計或 pH 比色管或精密 pH 試紙。菌落計數器。培養基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（Lauryl Sulfate Tryptose , LST）肉湯：見附錄A中。,BGLB肉湯：見附錄A中。,VRBA :見附錄A中。煌綠乳糖膽鹽（ Brilliant Green Lactose Bile結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（ Violet Red Bil

3、e Agar磷酸鹽緩沖液：見附錄 A 中。無菌生理鹽水：見附錄 A 中。無菌1 mol/L NaOH :見附錄A中。無菌1 mol/L HCl ：見附錄 A 中。大腸菌群MPN計數法檢驗程序大腸菌群MP計數的檢驗程序見圖1。圖1大腸菌群MPN計數法檢驗程序操作步驟樣品的稀釋固體和半固體樣品：稱取 25 g 樣品,放入盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質杯內，8000 r/min 10000 r/min 均質1 min2 min,或放入盛有225mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌均質袋中，用拍擊式均質器拍打 1 min2min,制成1:10的樣品勻液。液體樣品：以無菌吸管吸取 25

4、 mL 樣品置盛有225 mL 磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌錐形瓶（瓶內預置適當數量的無菌玻璃珠）中，充分混勻，制成 1:10 的樣品勻液。樣品勻液的pH值應在 之間，必要時分別用1 mol/L NaOH或1 mol/L HCl調節。用1 mL無菌吸管或微量移液器吸取1:10樣品勻液1 mL,沿管壁緩緩注入9 mL磷酸鹽緩沖液或生理鹽水的無菌試管中（注意吸管或吸頭尖端不要觸及稀釋液面），振搖試管或換用 1 支1 mL 無菌吸管反復吹打，使其混合均勻，制成 1:100的樣品勻液。根據對樣品污染狀況的估計，按上述操作，依次制成十倍遞增系列稀釋樣品勻液。每遞增稀釋 1 次，換用1 支1 mL 無菌吸

5、管或吸頭。從制備樣品勻液至樣品接種完畢，全過程不得超過 15 min 。初發酵試驗每個樣品，選擇 3個適宜的連續稀釋度的樣品勻液（液體樣品可以選擇原液），每個稀釋度接種3管月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST）肉湯，每管接種1mL（如接種量超過1 mL則用雙料LST肉湯），36C± 1 C培養24 h±2 h,觀察倒管內是否有氣泡產生， 24 h ± 2 h 產氣者進行復發酵試驗，如未產氣則繼續培養至48 h±2 h ，產氣者進行復發酵試驗。未產氣者為大腸菌群陰性。復發酵試驗用接種環從產氣的LST肉湯管中分別取培養物1環，移種于煌綠乳糖膽鹽肉湯（BGLB管中，3

6、6 r±C培養48 h ±2 h，觀察產氣情況。產氣者，計為大腸菌群陽性管。大腸菌群最可能數（MPN的報告按確證的大腸菌群LST陽性管數，檢索MP表（見附錄B）,報告每g （mL）樣品中 大腸菌群的MP值。大腸菌群平板計數法檢驗程序大腸菌群平板計數法的檢驗程序見圖 2。圖 2 大腸菌群平板計數法檢驗程序操作步驟 樣品的稀釋按進行。平板計數 選取2個3個適宜的連續稀釋度，每個稀釋度接種2個無菌平皿，每皿1 mb同時取1 mL生理鹽水加入無菌平皿作空白對照。及時將15 m20 m冷至46 C的結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（VRBA約傾注于每個平皿中。小心旋轉平皿，將培養基與樣液充分混勻

7、，待瓊脂凝固后，再加3 mL4 mLVRB覆蓋平板表層。翻轉平板，置于36 C± 1 C培養18 h24 h。平板菌落數的選擇選取菌落數在15 CFU-150 CFU之間的平板，分別計數平板上出現的典型和可疑大腸菌群菌落。典型菌落為紫紅色，菌落周圍有紅色的膽鹽沉淀環，菌落直徑為 mm 或更大。證實試驗從VRBA平板上挑取10個不同類型的典型和可疑菌落，分別移種于 BGLB肉湯管培養24 h48 h，觀察產氣情況。凡BGLB肉湯管產氣，即可報告為大腸菌群陽性。大腸菌群平板計數的報告經最后證實為大腸菌群陽性的試管比例乘以中計數的平板菌落數， 再乘以稀釋倍數，即為每g （mL樣品中大腸菌群

8、數。例：10-4樣品稀釋液1 mL，在VRB平板上有100個典型和可疑菌落，挑取其中10個接種BGL肉湯管，證實有6個陽性管,則該樣品的大腸菌群數為：100X 6/10 X 104/g ( mL =x 105CFU/g( mL。附錄A規范性附錄）培養基和試劑月桂基硫酸鹽胰蛋白胨（LST肉湯 成分胰蛋白胨或胰酪胨 g氯化鈉 g乳糖 g 磷酸氫二鉀（K2HPO)4 g磷酸二氫鉀（KH2PO)4 g月桂基硫酸鈉 蒸餾水 1 000 mL pH ±制法 將上述成分溶解于蒸餾水中，調節 pH。分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10mb 121 °C 高壓滅菌 15 min。煌綠乳糖膽鹽

9、（BGLB肉湯成分 蛋白胨 g乳糖 g牛膽粉（oxgall 或oxbile ）溶液 200 mL%煌綠水溶液 mL蒸餾水 800 mL pH ±制法 將蛋白胨、乳糖溶于約500 m蒸餾水中，加入牛膽粉溶液200 mL（將g脫水牛膽 粉溶于200 m蒸餾水中，調節pH至），用蒸餾水稀釋到975 mL調節pH,再加入皇綠水溶液mL,用蒸餾水補足到1 000 mL用棉花過濾后，分裝到有玻璃小倒管的試管中，每管10 mL。121 C高壓滅菌15 min。結晶紫中性紅膽鹽瓊脂（ VRBA）成分 蛋白胨 酵母膏乳糖 g氯化鈉g膽鹽或 3號膽鹽 g中性紅 g結晶紫 g瓊脂 15 g 18 g蒸餾水

10、 1 000 mL pH ±制法將上述成分溶于蒸餾水中，靜置幾分鐘，充分攪拌，調節pHo煮沸2 min，將培養基冷卻至45 C50 C傾注平板。使用前臨時制備，不得超過 3 h。磷酸鹽緩沖液成分 磷酸二氫鉀（ KH2PO）4 g蒸餾水 500 mL pH制法 貯存液：稱取g的磷酸二氫鉀溶于500 mL蒸餾水中，用大約175 mL的1 mol/L氫氧化鈉溶液調節pH,用蒸餾水稀釋至1 000 mL后貯存于冰箱。稀釋液：取貯存液mL,用蒸餾水稀釋至1 000 mL,分裝于適宜容器中，121 C高壓滅菌 15 min 。無菌生理鹽水成分 氯化鈉 g蒸餾水 1 000 mL制法 稱取g氯化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121 C高壓滅菌15 min。1 mol/L NaOH成分NaOH g蒸餾水 1000 mL制法 稱取40 g氫氧化鈉溶于1 000 mL蒸餾水中，121