1、博士研究生科研計劃書()姓 名：報考專業：計劃書題目：細胞角蛋白CK20對胃癌微轉移的預測價侑及臨床意義2013年2月、立題依據城 重點介紹本項目的科學意義、國內外現狀，弁附主要參考文獻 Jr7胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，居消化道腫瘤發病率之首，多見于男性，男女發病率之比為2:1 ,死亡率居惡性腫瘤首位，平均死亡年齡為61. 6歲。臨床上診斷的多為進展期胃癌患者，即使經標準的根治性手術治療，其5年生存率仍在40%左右，其中最重要的原因是胃癌患者術后了腹膜轉移。近年來在臨床開展的術前輔助化療，也即新輔助化療(neoadjuvantchemotherapy, NACT)是指在惡性腫瘤局部治療、手術

2、或放療前給予的全身或局部化療，也稱術前化療(preoperative chemotherapy)。新輔助化療是對腫瘤外科醫生及內科醫生觀念上的一個挑戰，其理論依據是：手術切除原發腫瘤可能會刺激剩余腫瘤細胞的生長；腫瘤周圍組織在術后血供改變影響化療藥物濃度及放療效果；新輔助化療、放療的組織病理學反應與預后呈正相關：可以達到預期的目的以提高手術切除率，減少術中播散可能性，降低腫瘤細胞活性；消除潛在的微轉移灶，降低術后轉移復發的可能；術前通過可測量病灶及術后標本準確判定臨床緩解率和病理學有效率；新輔助治療可剔除不宜手術治療的患者。新輔助化療使進展期胃癌治療的效果得到顯著改善，Wilke等1和Pluk

3、ker 2的II期臨床試驗發現，NACT能夠使原剖腹探查無法切除的胃癌獲得30%-50%的再切除率，這些再切除患者的中位生存期為24個月，遠高于原無法切除患者小于6個月的生存期。胃癌的腹膜轉移和復發占所有胃癌術后復發的半數以上，而腹膜轉移者的5年生存率低于20% o臨床所遇腹膜轉移患者多數在已出現腹水、盆腔腫塊或腸梗阻時才得以確診，已失去治療最好時機，故胃癌腹膜轉移的早期診斷和治療具有重要意義。腹膜轉移的關鍵因素是腹腔內脫落的癌細胞和腹膜微轉移灶的存在。微轉移是指在手術治療時已經存在的各種機體組織、及細胞移植物中的腫瘤殘留，是用常規形態學診斷技術不能檢測出的、隱匿在原發灶以外的轉移。胃癌腹膜微

4、轉移指術前或術中常規檢查難以發現的，單個癌細胞或一小簇癌細胞構成的種植于腹膜的微小轉移。胃癌腹膜轉移發生的途徑和步驟可能為：1.原發灶的腫瘤細胞穿透漿膜，脫落到腹腔內，形成高度生物活性的游離腫瘤細胞。2.在一些因子的介導下粘附在腹膜上。3.在基質消化酶和相關因子的作用下，腫瘤細胞向腹膜組織浸潤。4.腫瘤細胞不斷增值，形成種植結節3。前3個階段為微轉移階段，肉眼不可見，亦無法用影像學方法或常規HE染色診斷，須通過免疫組織化學或PCR等方法檢測腫瘤特異性標志物。第 4階段已經形成肉眼或影像學檢查可見的轉移。近年來，組織化學和分子生物學技術的迅速發展使得微轉移領域也有了較快的發展；隨著免疫組化和(R

5、T-PCR)方法的應用越來越趨向于成熟化和規范化，微轉移檢測領域日益受到重視，腫瘤微轉移的檢測可望成為腫瘤患者的常規檢查。目刖對于胃強腹膜微轉移診斷陽研究多集中仕對腹腔內脫落痛細胞(ECC)陽研究，具中最荷便、常用的是腹腔灌洗液細胞學檢查印，但是PLC的陽性率低。隨著免疫細胞化學和逆轉錄一聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction, RT-PCR)方法的發展和應用，ECC 的檢出率大大提高。但腹腔內脫落的癌細胞必須粘附于腹膜、著床弁增殖方可形成微轉移灶和轉移灶。所以腹膜組織內種植癌細胞的檢測，可以更直觀地證實胃癌腹膜微轉移的存在

6、。目前對于胃癌腹膜微轉移的研究已經越來越多，但大多數都是針對腹腔沖洗液、腹腔脫落細胞進行研究；術中取腹膜組織進行檢測的，較少報道，而像本試驗一樣，術中多處取材，取橫結腸系膜前葉、網膜囊后壁近胰腺上緣處、胰腺被膜、盆底腹膜組織，檢測胃癌腹膜微轉移者，尚無報道。本試驗證實免疫組化法檢測細胞角蛋白CK20能夠檢測胃癌腹膜微轉移，并為胃癌根治術術式的胃癌細胞比較容易通過脫落種植，淋巴轉移等途徑擴散到胃周系膜組織內。如果能在在胃癌根治術中對多處腹膜組織進行活檢，行免疫組化染色，檢測CK20 ,弁與常規 HE染色及PLC檢查結果相比較。結果表明，雖然常規HE染色檢查弁不能發現，實際上橫結腸系膜前葉、胰腺被

7、膜和胰腺上方的網膜囊后壁等處組織內確實已存在微轉移灶，以保障手術的徹底性.腹腔化療是一操作簡單而行之有效的治療方法，能改善經靜脈化療無法完成的腹腔內游離癌細胞陽性和鏡下腹膜轉移患者的抗腫瘤果，可治療進展期胃癌術后腹腔殘存微小癌灶，弁防止腹腔復發。可以通過術中腹腔內置化療藥物緩釋劑或術后通過留置導管腹腔內給藥。腹腔化療目前尚無統一的用藥標準，正逐步由單一用藥向聯合用藥發展。腹腔化療一般很少發生嚴重弁發癥，與靜脈化療相比，其全身弁發癥及副作用的發生率較低，但局部弁發癥的發生率較高，應注意預防(刑會軍)及早診斷胃癌腹膜微轉移，對于胃癌復發和預后的判斷及指導臨床治療有著極其重要的意義。臨床所見的胃癌多

8、為進展期胃癌，約50%的患者術后可發生腹膜轉移4。發生腹膜轉移的患者對靜脈輔助化療、放療等治療手段均不敏感，生存率較低。故及早現腹膜微轉移，早期治療，預防和阻 斷腹膜轉移的發生顯得尤為重要，而對于已發生腹膜轉移的患者，可通過減瘤手術配合腹腔化療，以 期延長患者的生存時間。1 Wilke H, Preusser P, Fink U, et al. Preoperative chemotherapy in locallyadvanced and nonresectablegastric cancer:a phase II study with etoposide, doxorubicin, and

9、 cisplatin J . J Clin Oncol,1989,7:1318-1326.2 Plukker JT, Mulder NH, Sleijfer DT, et al, Chemotherapy and surgery for locallyadvanced cancer of thecardia and fundus: phase II studywith methotrexate and 5-fluorouracill J . Br J Surg, 1991, 78: 955-958.3吳晴，程海霞，李兆中 .疾病分冊.2005, 25 (3):胃癌腹膜微轉移的基因研究進展J.國

10、外醫學.消化139-143.4 Tanak T,Kumagai K,Shimizu K,et al. Peritoneal metastasis in gastric cancer with particular reference tolymphatic advancement ;extranodal invasion is agnificant risk factor for peritoneal metastasis.J Surg Onco1,2000,75:165-171.8:、研究內容y研究目標、研究內容、創新之處和擬解決的關鍵問題CK20 ,弁與常規 HE染本研究在胃癌根治術中對多

11、處腹膜組織進行活檢，行免疫組化染色，檢測色及PLC檢查結果相比較。雖然常規HE染色檢查弁不能發現，胰腺被膜、橫結腸系膜前葉、和胰腺上方的網膜囊后壁等處組織內確實已存在微轉移灶，弁且微轉移發生概率與腫瘤大小、侵透漿膜等因素相關。因此對于進展期胃癌，尤其是腫瘤較大、侵透漿膜者，應該剝離橫結腸系膜前葉、胰腺被膜的網膜囊后壁，爭取做到網膜囊完整切除，以保證手術的根治性。胃癌腹膜轉移發生的途徑和步驟可能為：1.原發灶的腫瘤細胞穿透漿膜，脫落到腹腔內，形成高度生物活性的游離腫瘤細胞。2.在一些相關因子的介導下粘附在腹膜上。3.在基質消化酶和相關因子的作用下，腫瘤細胞向腹膜組織浸潤。4.腫瘤細胞不斷增值，形

12、成種植結節。第4階段已經形成肉眼或影像學檢查可見的轉移，弁可由常規病理檢查確定。前3個階段為微轉移階段，肉眼不可見，亦無法用影像學方法或常規 HE染色診斷， 必須通過免疫組織化學或PCR等方法檢測腫瘤特異性標志物。近年來,組織化學和分子生物學技術的迅速發展使得微轉移領域也有了較快的發展；隨著免疫組化和逆轉錄一聚合酶鏈反應（RT-PCR）方法的應用越來越趨向于成熟化和規范化，微轉移檢測領域日益受到重視，腫瘤 微轉移的檢測可望成為腫瘤患者的常規檢查。雖然取腹腔沖洗液檢查具有操作簡便、花費較少等優點，但無論是細胞學檢查、化學發光酶聯免疫法或RT-PCR技術，僅僅只是確定游離癌細胞的存在，這些檢測方法

13、通胃癌術中取腹膜組織檢測微轉移的研究國內外較少報道，是近年來比較新的研究領域。術中取材部位有直腸膀膚陷凹（直腸子宮陷凹）、橫結腸系膜、大網膜等，檢測方法主要有免疫組織化學方法和RT-PCR。取腹膜組織檢測胃癌腹膜微轉移，其陽性率一般低于取腹腔灌洗液用同種方法檢測的結果。這是因為腹膜取材具有一定的局 限性，但不能確診腹膜微轉移游離的腫瘤細胞必須經過粘附、降解腹膜細胞外基質、著床于腹膜間皮組織弁增殖才能形成腹膜微轉移.另外脫落的腫瘤細胞必須經過粘附、浸潤、 增值等階段才能形成腹膜微轉移。因此，取腹膜組織檢測可以直觀地證實腹膜微轉移灶的存在。過確定游離癌細胞的存在，對 腹膜轉移、復發有一定的預測價值

14、.本研究于胃癌根治術中自橫結腸系膜前葉、網膜囊后壁近胰腺上緣處、盆底腹膜處取活，用免疫組化方法檢測細胞角蛋白CK20 ,研究胃癌患者腹膜微轉移的情況，胃癌根治手術經過一個多世紀的發展已經相當成熟，近年來在進展期胃痛根治術中，剝蜀橫結腸系膜麗葉和胰腺被膜已逐漸成為常規,弁有學者提出了胃全系膜切除和胃癌根治術中網膜囊完整切除的概念，以求達到根治。胃全系膜切除術是指完整切除胃腹側、背側系膜內所有的組織結構，包括胃及其血管和淋巴脂肪組織。網膜囊完整切除是指將網膜囊的后壁與前壁及胃（包括周圍淋巴脂肪組織）。但胃周系膜內是否存胃癌微轉移灶分析腹膜微轉移與胃癌大小、侵透膜與否、腫瘤分期、淋巴結轉移等臨床因素

15、的關系，探討胃癌腹膜微轉發生的因素和微轉移的規律，為手術方式選擇、判斷預后及建立個體化的術后治療方案提供更可靠的依據。鑒于胃癌行淋巴結清掃一直缺乏較為可靠的理論依據，且剝離操作易進入錯誤分離層面，造成出血、系膜剝離不全、術后淋巴漏、胰漏等，故對于進展期胃癌是否應該行此術式值得探討。胃周圍系膜表面上無關聯，但在胚胎解剖學上具有高度的組織同源性。在胚胎時期，胃腹側系膜在前腸旋轉中形成小網膜，胃背側系膜的前后兩層則廣泛覆蓋胃、脾、胰腺，衍化成為大網膜、胃脾韌帶、胰腺被膜等。在胚胎時期前腸旋轉中，胃周圍系膜與系膜、系膜與臟器和后腹壁相互靠近弁貼在一起發生融合，形成潛在的，分布廣泛的，充滿淋巴組織和疏松

16、結締組織的間隙l ,容許惡性病變沿其擴散、蔓延。胃癌細胞比較容易通過脫落種植，淋巴轉移等途徑擴散到胃周系膜組織內。如果能在在胃癌根治術中對多處腹膜組織進行活檢，行免疫組化染色，檢測 CK20 ,弁與常規HE染色及PLC檢查結果相比較。結果表明，雖然常規HE染色檢查弁不能發現，實際上橫結腸系膜前葉、胰腺被膜和胰腺上方的網膜囊后壁等處組織內確實已存在微轉移灶，弁且微轉移發生概率與腫瘤大小、侵透漿膜等因素相關。因此對于進展期胃癌，尤其是腫瘤較大、侵透漿膜者，應該剝離橫結腸系膜前葉、胰腺被膜和胰腺上方的網膜囊后壁，爭取做到網膜囊完整切除，以保證手術的根治性。另外淋巴轉移途徑在腹膜微轉移中占有一定的地位

17、，胃癌根治術中必須嚴格行D2淋巴結清掃。三、擬采取的研究方法、技術路線選取術前影像學檢查及手術中探查未發現周圍臟器侵犯（如：肝臟、胰腺、橫結腸及其系膜等）、遠處轉移的患者胃癌腫瘤標本。患者術中為減少腹腔游離癌細胞和脫落種植轉移，均實行腹腔高溫灌 洗，術后進行常規病理學檢查以及脫落細胞學和腹腔灌洗液檢查，腹腔沖洗液細胞學檢查采用轉速控制在1600轉/分的低速離心機，上清液去除， 沉渣圖片行瑞氏染色，鏡下觀察。 檢測到癌細胞即為陽性。弁去腹膜組織做HE染色，標本來自橫結腸系膜、男性直腸膀胱陷凹（女性為直腸子宮陷凹）以及網膜囊后壁，采用免疫組化的方法（免疫組化染色采用鏈霉菌抗生物素蛋白一過氧化酶連接

18、（sP）法）檢查CK20 ,與腹腔灌洗液體細胞學檢查做對比。CK20陽性者，視為轉移，所取不同部位的腹膜組織有一處陽性者即認為發生了腹膜微轉移。CK20存在于上皮來源的腫瘤之中，表達于細胞漿，以胞漿染為淡黃色到深棕黃色，染色強度明顯高于背景者為陽性。凡無黃色染色且顯色強度與背景無明顯差別者為陰性（圖5）。本試驗中若HE染色陰性，而 CK20陽性者，即視為該處腹膜組織發生了微轉移。同一病人所取的橫結腸系膜前葉、網膜囊后壁近胰腺上緣處、直腸膀膚陷凹（直腸子宮陷凹）腹膜組織中有一處或一處以上發生微轉移者，視為發生了腹膜微轉移。比較免疫組化Ck20腹膜微轉移的陽性率與腹腔灌洗液細胞學檢查的陽性率。應用SPSS統計軟件進行數據分析。是否發生腹膜微轉移與腫瘤侵漿膜與否，淋巴結轉移等臨床資料的分析采用卡方檢驗。四、考核指標y預期成果隨著免疫組織學和分子生物學技術的不斷進步，胃癌微轉移的檢測手段也越來越可靠，這將為臨床工作中判斷預后、選擇術式、確定淋巴結清掃范圍、術后確立分期及建立個體化的化療方案提供更可靠的依據， 在胃癌的診治中發揮更加重要的作用。由于大量文獻中所表現