1、附錄XII A無菌檢査法無菌檢査法系用于檢查藥典要求無菌的生物制品、醫療器具、原料、輔料及其他品種是 否無菌的一種方法。若供試品符合無菌檢査法的規立，僅表明了供試品在該檢驗條件下未發 現微生物污染。無菌檢査應在潔凈度萬級下的局部潔凈度百級的單向流空氣區域內或隔離系統中進行, 其全過程應嚴格遵守無菌操作，防止微生物污染，防止污染的措施不得影響供試品中微生物 的檢出。單向流空氣區、工作臺而及環境應立期按醫藥工業潔凈室（區）懸浮粒子、浮游 菌和沉降菌的測試方法的現行國家標準進行潔凈度驗證。隔離系統應按相關的要求進行驗 證，其內部環境的潔凈度須符合無菌檢查的要求。日常檢驗還需對試驗環境進行監控。無菌檢

2、查人員必須具備微生物專業知識，并經過無菌技術的培訓。培養基培養基的制備:培養基按以下處方制備,亦可用按該處方生產的符合規定的脫水培養基。 配制后應采用驗證合格的火菌程序火菌。制備好的培養基應保存在225°C避光的環境，若 保存于非密閉容器中，一般可在3周內使用：若保存于密閉容器中，一般可在1年內使用。1、硫乙醇酸鹽流體培養基酪腺（胰酶水解）15.0g酵母浸出粉5.0g匍萄糖5.0g氯化鈉2.5gL-胱氨酸0.5g新配制的0.1%刃天青溶液l.OmL硫乙醇酸鈉0.5g（或硫乙醇酸0.3mL)瓊脂0.75g水lOOOmL除痢萄糖和刃天青溶液外，取上述成分混合，微溫溶解，調pH值為弱堿性，

3、煮沸，濾 淸，加入水痢萄糖和刃天青溶液，搖勻，調pH值使滅菌后為7.1±0.2。分裝至適宜的容器中， 其裝量與容器髙度的比例應符合培養結束后培養基氧化層（粉紅色）不超過培養基深度的 1/2,火菌。在供試品接種前，培養基氧化層的高度不得超過培養基深度的1/5,否則，須經 1000*C水浴加熱至粉紅色消失（不超過20分鐘）后，迅速冷卻，只限加熱一次，并防止被 污染。2、改良馬丁培養基50g磷酸氫二鉀l.Og酵母浸岀粉2.0g硫酸鎂0.5g匍萄糖20.0g水1000mL除匍萄糖外,取上述成分混合,.微溫溶解，調pH值約為6.8»煮沸；加入putaotang溶解后，搖勻，濾淸，調p

4、H值使火菌后為6.4±0.2,分裝，火菌。3、選擇性培養基按上述硫乙醇鹽流體培養基或改良馬丁培養基的處方及制法，在培養基火菌或使用前加 入適宜的中和劑、滅活劑或表而活性劑，其用量同方法驗證試驗。4、營養肉湯培養基陳lO.Og氯化鈉5.0g牛肉浸岀粉3.0g水1000mL取上述成分混合，微溫溶解，調pH值為弱堿性，煮沸，濾淸，調pH值使火菌后為7.2±0.2, 分裝，滅菌。5、營養瓊脂培養基按上述營養肉湯培養基的處方及制法，加入14.0g瓊脂，調pH值使滅菌后為7.2±0.2, 分裝，滅菌。6、改良馬丁瓊脂培養基按改良馬丁培養基的處方及制法，加入14.0g瓊脂，調p

5、H值使滅菌后為6.4±0.2,分裝， 滅菌。培養基的適用性檢査無菌檢査用的硫乙醇酸鹽流體培養基及改良馬丁培養基應符合 培養基的無菌性檢查及靈敏度檢査的要求。本檢查可在供試品的無菌檢查前或與供試品的無 菌檢查同時進行。培養基的無菌性檢査 每批培養基隨機抽取不少于10支(瓶)，5支(瓶)置3035°C、 另5支(瓶)2025°C培養14天，均應無菌生長。靈敏度檢査菌種 培養基靈敏度檢查所用的菌株傳代次數不得超過5代(從菌種保藏中心獲得的冷 凍燥菌種為第0代)，試驗用菌種應采用適宜的菌種保藏技術進行保存，以保證試驗菌株 的生物學特性。金黃色葡萄球菌(staphyloco

6、ccus aureus) CMCC (B) 26003 銅綠假單胞菌(Pseudomonas aeruginosa) CMCC (B) 10104 枯草芽抱桿菌(Bacillussubtilis) CMCC (B) 63501 生抱梭菌(Clostridium sporogenes) CMCC (B) 64941 白色念珠菌(Candida albicans) CMCC (F) 98001 黑曲霍(Aspergillus niger) CMCC (F) 98003菌液制備 接種金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽砲桿菌的新鮮培養物至營養肉 湯培養基中或營養瓊脂培養基上，接種生抱梭菌的新鮮培養物

7、至硫乙醇酸鹽流體培養基中, 3035°C培養1824小時；接種白色念珠菌的新鮮培養物至改良馬丁培養基中或改良馬丁瓊 脂培養基上，2025°C培養2448小時，上述培養物用0.9%氯化鈉溶液制成每ImL含菌數小 于100CFU (菌落形成單位)的菌懸液。接種黑曲篷的新鮮培養物至改良馬丁瓊脂培養基上， 2328°C培養57天，加入35mL無菌的含0.05%(ml/ml)聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液， 將抱子洗脫。然后，用適宜的方法吸出抱子懸液至無菌試管內，用無菌的含0.05%(ml/ml) 聚山梨酯80的0.9%氯化鈉溶液制成每lml含砲子數小于100CFU的包子

8、懸液。菌懸液在室溫下放宜應在2小室內使用，若保存于28°C可在24小時內使用。黑曲霊 抱子懸液可保存在28°C,在驗證過的貯存期內使用。培養基接種 取每管裝量為12mL的硫乙醇酸鹽流體培養基9支，分別接種小于 100CFU的金黃色匍萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽抱桿菌、生抱梭菌各2支，另1支不接 種，作為空白對照，置3035°C培養3天：取每管裝量為9mL的改良馬丁培養基5支，分別 接種小于100CFU的白色念珠菌、黑曲霉各2支，另一支不接種，作為空白對照，置2025°C 培養5天。逐日觀察結果。結果判定 空白對照管應無菌生長，若加菌的培養基管均生長良好，

9、判斷該培養基的靈 敏度檢査符合規定。稀釋液、沖洗液及制備方法稀釋液、沖洗液配制后應采用驗證合格的滅菌程序滅菌。稱取蛋白l.Og,加水lOOOmL,微溫溶解，濾淸,調pH值至7.1±0.2,分裝，滅菌。(2) pH7.0氯化鈉-蛋白腺緩沖液，稱取磷酸二氫鉀3.56g、磷酸氫二鈉7.23g、氯化鈉4.30g、 蛋白腺：LOg,加水lOOOmL,微溫溶解，濾淸，分裝，滅菌。(3) 0.9%氯化鈉溶液稱取氯化鈉9.0g,加水溶解使成lOOOmL,過濾，分裝，火菌(僅用于上述2種溶液不適合時使用)。根據供試品的特性可選用其它經驗證過的適宜的溶液作為稀釋液、沖洗液。如需要，可 在上述稀釋液或沖洗

10、液的火菌前或火菌后加入表而活性劑或中和劑等。方法驗證試驗當建立產品的無菌檢查法時是，應進行方法的驗證，以證明所采用的方法適合于該產品 的無菌檢查。若該產品的組分或原檢驗條件發生改變時，檢查方法應重新驗證。驗證時，按 “供試品的無菌檢査”的規左及下列要求進行操作。對每一試驗菌應逐一進行驗證。菌種及菌液制備同培養基靈敏度檢查薄膜過濾法 取每種培養基規泄接種的供試品總量按薄膜過濾法過濾，沖洗，在最后一 次的沖洗液中加入小于100CFU的試驗菌，過濾。將培養基加至濾筒內。另取一裝有同體積 培養基的容器，加入等量試驗菌，作為對照，細菌3035°C.真菌置2025°C培養35天， 逐日

11、觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。宜接接種法取符合直接接種法培養基用量要求的硫乙醇酸鹽流體培養基8管，分別接 入小于100CFU的金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽泡桿菌、生抱梭菌各2管，取符 合直接接種法培養基用量要求的改良馬丁培養基4管,分別接入小于100CFU的白色念珠菌、 黑曲每各2管。其中1管接入每支培養基規圧量的供試品量，另1管作為對照，細菌豊3035°C、 真菌程2025°C培養35天，逐日觀察各濾筒內試驗菌的生長情況。結果判定 與對照管比較，如含供試品的各容器中的試驗菌均生長良好，則說明供試 品的該檢驗量在該檢驗條件下無抑菌作用或英抑菌作用可以忽略不計，照此檢

12、査方法和檢查 條件進行供試品的無菌檢查。如含供試品的任一容器中的試驗菌生長微弱、緩慢或不生長， 則說明供試品的改檢驗量在該檢驗條件下有抑菌作用，可采用增加沖洗量、增加培養基的用 量、使用中和劑或火活劑、更換濾膜品種等方法，消除供試品的抑菌作用，并重新進行方法 驗證試驗。驗證試驗也可與供試品的無菌檢査同時進行。供試品的無菌檢查抽驗數量系指一次試驗所用供試品最小包裝容器的數疑（支或瓶）。成品每亞批均應進 行無菌檢査。除另有規泄外，原液、半成品及成品按表1規定，上市產品監督檢驗按表2 規定。接種量 系指每個最小包裝的最小取樣量（mL或g）。除另有規定外，接種供試品量 按表3規定。若采用宜接接種法，按

13、接種量要求等疑分別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改 良馬丁培養基中兩種培養基的接種支（瓶）數之比為2： 1；若采用薄膜過濾法，應采用三 聯薄膜過濾器，苴中兩聯加入硫乙醇酸鹽流體培養基，另一聯加入改良馬丁培養基。只要供 試品特性允許，應將所有容器內的內容物全部過濾。陽性對照以金黃色匍萄球菌作為陽性對照菌。供試品用量同供試品無菌檢査每份培養 基接種的樣品星。陽性對照試驗的菌液制備同培養基靈敏度檢查項下金黃色匍萄球菌菌液制 備方法，加菌量小于lOOCFUo陽性對照液可在供試品無菌檢查培養14天后，取英中1份硫 乙醇酸鹽流體培養基，加入小于100CFU陽性對照菌，作為陽性對照。陽性對照巻3035

14、6;C 培養4曠72小時應生長良好。陰性對照 供試品無菌檢查時，應取相應溶劑、稀釋液和沖洗液同法操作，作為陰性對 照。陰性對照不得有菌生長。無菌試驗過程中，若需要使用表而活性劑、火活劑、中和劑等試劑，應證明其有效性， 且對微生物生長無毒性。無菌檢査法包括薄膜過濾法和直接接種法。只要供試品性狀允許，應采用薄膜過濾法。 供試品的無菌檢查所采用的檢査方法和檢驗條件應與驗證的方法相同。操作時，用適宜的消毒液對供試品容器表面進行徹底消毒。如果供試品容器內有一泄的 真空度，可用適宜的無菌器材（如帶有除菌過濾器的針頭）向容器內導入無菌空氣，再按無 菌操作啟開容器，取出內容物。3 / 6供試品處理及接種培養基

15、除另有規左外，按下列方法進行。1、薄膜過濾法采用封閉式薄膜過濾器，濾膜孔徑應不大于0.45pm,直徑約為50mm.根據供試品及 其溶劑的特性選擇濾膜材質。使用時，應保證濾膜在過濾前后的完整性。水溶性供試品溶液過濾前先將少量的沖洗液過濾，以濕潤濾膜。油類供試品，苴濾膜和 過濾器在使用前應充分干燥。為發揮濾膜的最大過濾效率，應注意保持供試品溶液及沖洗液 覆蓋整個濾膜表而。供試品溶液經濾膜過濾后，若需要沖洗液沖洗濾膜，每張濾膜每次沖洗 量一般為100mL,總沖洗量不得超過lOOOmL,以避免濾膜上的微生物受損傷。水溶液供試品取規定量，每支（瓶）供試品裝量為SmL及以下者，全部轉移至含適 量稀釋液的無

16、菌容器內，混勻，立即過濾。如供試品具有抑菌作用或含防腐劑，須用沖洗液 沖洗濾膜，沖洗次數一般不少于3次，所用的沖洗疑、沖洗方法同方法驗證試驗。沖洗后， 2個濾器中加入硫乙醇酸鹽流體培養基各100mL,另一濾器中加入改良馬丁培養基。水溶性固體供試品 取規怎量，加適宜的稀釋液溶解或按標簽說明復溶，然后照水溶 液供試品項下的方法操作。非水溶性供試品 取規立量，混合溶于含聚山梨酯80或其他適宜乳化劑的稀釋液 300mL的無菌容器內，充分混合，立即過濾。用含0.1%1%聚山梨酯80的沖洗液沖洗濾膜， 沖洗次數一般不少于3次。加入含或不含聚山梨酯80的培養基。其他照水溶液供試品項下 的方法操作。可溶于十四

17、烷酸異丙酯的膏劑和黏性油劑供試品取規疋量，混介至適量的無菌十四 烷酸異丙酯中，劇烈振搖，使供試品充分溶解。如果需要可適當加熱，但溫度不得超過44C, 并趁熱迅速過濾。對仍然無法過濾的供試品，于含有適量的無菌十四烷酸異丙酯中的供試品 溶液中加入不少于100mL的稀釋液，充分振搖萃取，靜垃，取下層水相作為供試品溶液過 濾，過濾后濾膜沖洗及加入培養基照非水溶性供試品項下的方法操作。無菌氣（噴）霧劑供試品 取規定量，將各容器置至少-20C的冰室冷凍至少約1小時。 以無菌操作迅速在容器上端鉆一小孔釋放拋射劑后再無菌開啟容器，并將供試品溶液轉移至 無菌容器中，然后照水容額或非水溶性制劑供試品項下的方法操作

18、。裝有藥物的注射器供試品取規泄量，將注射器中的內容物（若需要可吸入稀釋液或 標簽所示的溶劑溶解）直接過濾，或混合至含適疑稀釋液的無菌容器內，混勻，立即過濾, 然后按水溶性供試品項下方法操作。同時應采用直接接種法進行包裝中所配帶的無菌針頭的無菌檢査。2、直接接種法直接接種法適用于無法用薄膜過濾法進行無菌檢查的供試品。取規立量供試品，等量分 別接種至硫乙醇酸鹽流體培養基和改良馬丁培養基中（2中培養基的接種支數或瓶數之比為 2： 1）。除另有規左外，每個容器中培養基的用量應符合接種的供試品體積，不得大于培養 基體積的10%,同時，硫乙醇酸鹽流體培養基每管裝量不少于15mL,改良馬丁培養基每管 裝量不

19、少于10mL.培養基的用量和高度同方法驗證試驗。混懸液等非澄清水溶液供試品取規泄量，等量分別接種至各管培養基中。固體供試品 取規圧量，加入適宜的稀釋劑溶解，或按標簽說明復溶后混合，等量分 別接種至各管培養基中。非水溶性供試品取規定量，混合，加入適量的聚山梨酯80或其他適宜的乳化劑及稀 釋劑使英乳化：等量分別接種至各管培養基中，或等量分別直接接種至含聚山梨酯80或其 他適宜乳化劑的各管培養基中。培養及觀察將上述接種后的硫乙醇酸鹽流體培養基平均分成兩份，一份置3035°C培 養14天；另一份與接種后的改良馬丁培養基2025°C培養14天，培養期間應逐日觀察并 記錄是否有菌生長。如在加入供試品后或在培養過程中，培養基出現渾濁，培養24天后， 不能從外觀上判斷有無菌生長，可取該培養液適量轉種至同種新鮮焙養基中及營養瓊脂斜而 和改良馬丁瓊脂斜而培養基上，細菌培養2天，真菌培養3天，觀察接種的同種新鮮培養基 及營養瓊脂和改良馬丁瓊脂斜而培養基上是否有菌，必要時做菌種鑒泄。結果判定陽性對照管應生長良好，陰性對照管不得有菌生長。否則試驗無效。若供試品管均澄淸，或雖顯渾濁但經確證無菌生長，判供試品符合規定；若供試品觀眾 任何一管顯渾濁并確證有菌生長，判供試品不符合規左，除非能充分證明試驗結果無效，即 生