1、dojindOM作說明細胞活性檢測1. 在 96 孔板中接種細胞懸液（100 ml / 孔 ） 。將培養板放在培養箱預培養（在37 C, 5% CO2的條件下 ）。2. 向每孔加入10 ml 的 CCK- 8 溶液 （ 注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響值的讀數）。3. 將培養板在培養箱內孵育1-4 小時。4. 用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。5. 如果暫時不測定值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 ml M HCl 溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。細胞增殖-毒性檢測1. 在 96 孔板中配制100 ml 的細胞懸

2、液。將培養板在培養箱預培養24小時（ 在37 C, 5% CO2的條件下 ）。2. 向培養板加入10 ml 不同濃度的待測物質。3. 將培養板在培養箱孵育一段適當的時間（ 例如 : 6,12, 24 或 48 小時 ）。4. 向每孔加入10 ml CCK-8 溶液 （ 注意不要在孔中生成氣泡，它們會影響值的讀數）。5. 將培養板在培養箱內孵育1-4 小時。6. 用酶標儀測定在450 nm 處的吸光度。7. 如果暫時不測定值，打算以后測定的話，可以向每孔中加入10 ml M HCl 溶液或者1%w/vSDS 溶液，并遮蓋培養板避光保存在室溫條件下。在24小時內吸光度不會發生變化。注意：如果待測物

3、質有氧化性或還原性的話，可在加CCK-8之前更換新鮮培養基，去掉藥物的影響。當然藥物影響比較小的情況可以不更換培養基，直接扣除培養基中加入藥物后的空白吸收即可。制作標準曲線1. 先用細胞計數板計數所制備的細胞懸液中的細胞數量，然后接種細胞。2. 按比例（ 例如： 1/2 比例 ） 依次用培養基等比稀釋成一個細胞濃度梯度，一般要做 3-5 個細胞濃度梯度，每組3-6 個復孔。3. 接種后培養2-4 小時使細胞貼壁，然后加CCK-8試劑培養一定時間后測定值，制作出一條以細胞數量為橫坐標（X 軸 ） ，值為縱坐標（Y 軸 ） 的標準曲線。根據此標準曲線可以測定出未知樣品的細胞數量（使用此標準曲線的前

4、提條件是實驗的條件要一致，便于確定細胞的接種數量以及加入CCK-8后的培養時間）。DOJIND啦測步驟CCK-8檢測步驟1 .向各孔中加入100膜 細胞懸液。a）2 .在37c下預孵育培養板。b）3 .向各孔中加入各濃度的待測溶液 c）10口。4 . 37 C下孵育。5 .向各孔中加入10 口 的CCK-8溶液d）。6 . 37 C下孵育1-4小時。e）7 .測定450 nm處的OD值。a）使用適當的培養基制備50,000-100,000個/ml的細胞懸液。b）建議使用CO邪養箱過夜預培養。c）使用培養基或PBS來制備溶液。d）如果待測溶液有還原性，測定不含細胞，但含有CCK-8的待測溶液在4

5、50 nm處的空白吸光度。如果該吸光度很小，則可以直接加入CCK-8,如果吸光度相對較大，則需要除去培養基，并用培養基洗滌細胞兩次，然后加入新的100/ 培養基和10nCCK-8進行檢測。e）白細胞可能需要培養較長時間。活力計算細胞活力* （%） =A（加藥）-A （空白）/A （0加藥）-A （空白）X 100A （加藥）：具有細胞、CCK-8溶液和藥物溶液的孔的吸光度A （空白）：具有培養基和CCK-8溶液而沒有細胞的孔的吸光度A （0加藥）：具有細胞、CCK-8溶液而沒有藥物溶液的孔的吸光度*細胞活力：細胞增殖活力或細胞毒性活力問答：1. 一個孔中應接種多少個細胞當使用標準96孔板時，貼

6、壁細胞的最小接種量至少為 1,000個/孔（100 口 培養基）。檢 測白細胞時的靈敏度相對較低，因此推薦接種量不低于2,500個/孔（100口培養基）。如果要使用24孔板或6孔板實驗，請先計算每孔相應的接種量，并按照每孔培養基總體積 的10劑口入CCK-8溶液。2. 能否用384孔板進行試驗可以。向各孔中加入培養基體積10%勺CCK-8溶液，如果加入的 CCK-8體積太少，可以先將CCK-8溶液稀釋1倍，然后加入培養基體積 20%勺量。3. 能否用 24 孔板進行試驗可以。向各孔中加入培養基體積10%勺CCK-8溶液。4. 酚紅會影響檢測嗎不會。 培養基中酚紅的吸光度可以在計算時，通過扣除空

7、白孔中本底的吸光度而消去，因此不會對檢測造成影響。與胸苷結合檢測之間是否有相關性有。然而，請注意由于 CCK-8使用的檢測原理與胸背檢測的不同，因此結果可能不同。能否檢測細菌細胞可以檢測，但不能檢測酵母細胞。向 100小 培養液中加入10小CCK8溶液，并培養1-4 個小時或過夜。穩定嗎CCK-8在0-5 C下能夠保存至少 6個月，在-20 C下避光可以保存 1年。如果需要長期保存，我們推薦-20 的儲藏條件。8 . 如果沒有450 nm 的濾光片，還可以使用哪些其他濾光片還可使用450 nm 到 490 nm 之間的濾光片。9 .如何減少由于 CCK-8試劑在槍頭上或孔壁上的殘留所帶來的誤差

8、可以在加樣前用培養基稀釋 CCK-8試劑并混勻后加樣。是什么顏色應該是粉紅色。若顏色不一樣，有可能會影響測定。能否對活細胞進行染色不能。因為CCK8的主要成分是一種水溶性的四吵鹽 （WST8）,并通過電子載體1Methoxy PMS 將活細胞中的電子交換到培養基中的 WST8E。由于生成的甲&也是高度水溶性的，因此CCK8 不能對細胞進行染色。檢測溶液對細胞是否有毒CCK8液自身因為高濃度的 IMethoxy PMS勺存在而具有一點毒性。但是，加到培養基中的 CCK8是沒有毒性的，因為被稀釋了10倍。因此，長時間的培養，如過夜或者培養數天是可以的。同一個細胞培養液在CCK8檢測后還可以用于其他

9、細胞增殖檢測，如結晶紫檢測，中性紅檢測或者 DNA熒光檢測等。由于每種細胞對于CCK8的耐受力都不同，因此在需要進行長時間培養時，先檢測一下細胞在加入CCK隔養后的活力。13. 在做加藥實驗時，藥物對測定是否有影響如何解決有時會有影響。如果藥物具有還原性，會和CCK8發生顯色反應，增加吸光度。解決辦法：首先要確認藥物是否有吸收，在含有藥物的培養基中加入CCK8測定450 nm的吸光度，如果它的吸光度比不含藥物的培養基（加CCK8兩吸光度高，則證明藥物有影響， 可在加CCK8之前更換培養基，去掉藥物的影響。14. 每次測定的數值不一樣，是什么原因如何解決可能會有以下幾個原因：1. 當在培養箱內培

10、養時，培養板最外一圈的孔最容易干燥揮發，由于體積不準確而增加誤差。一般情況下，最外一圈的孔只加培養基，不作為測定孔用。2.有可能會因為CCK8占在壁上而產生誤差，建議在加入CCK8后，輕輕敲擊培養板以幫助混勻。3. 每孔的細胞數量過多或過少。請預先在1,000100,000 個 /孔范圍內摸索條件。15. 如何設定空白對照在不含細胞的培養基中加入CCK8培養一定的時間，測定 450 nm的吸光度即為空白對照。在做加藥實驗（ 細胞毒性實驗）時，還應考慮藥物的吸收，可在不含細胞，加入藥物的培養基中加入CCK8培養一定的時間，測定 450 nm的吸光度作為空白對照。16. 哪些物質會影響CCK8的測

11、定當有還原性物質存在時會影響CCK8勺測定，例如含有維生素C的Glucose等（一般培養基中的量不多，酚紅或血清不影響測定）。在有酚紅存在的情況下，會增加空白吸收，但不影響測定，扣除空白吸收即可。17. 在實驗中吸光度值太高，如果不能減少細胞數量，如何解決可以縮短加入 CCK8后的培養時間。例如：可以把加入CCK8式劑后的培養時間由 2小時縮短 為 1 小時。18. 設定參比波長的目的是什么必須設定嗎不一定要設定。CCK-8試劑在參比波長沒有吸光度。設定參比波長的目的是為了取出由于樣 品混濁所帶來的吸收。19. 說明書上僅寫了96 孔板的測定方法，如果使用24 孔板貨12 孔板，應該加多少量C

12、CK-8試劑般情況下建議加入 CCK-8試劑的量是培養基體積的1/10。20. 在CCK-8顯色過程中，如何終止反應有一下幾種方法（96 孔板） ：1 、在顯色反應后，將培養板放置4冰箱內。2 、每孔加10以M HCL 溶液。3、每孔加10以1% （w/v）的SDS（十二烷基硫酸鈉）溶液。注意：反應停止后，應在24 小時之內測定。21. 必須預培養細胞嗎不一定。如果要向保持細胞的最好狀態，建議預培養細胞。如果不做細胞預培養，細胞內的脫氫酶可能會不穩定。也有人不做細胞預培養，但在做標準曲線和檢測時需要統一檢測條件。22. 如果加入的藥物中含有金屬，是否會有影響金屬對CCK-8顯色有影響。當終濃度

13、為1 Mm勺氯化亞鉛、氯化鐵、硫酸銅會抑制5% 15%90%勺顯色反應，使靈敏度降級。如果終濃度是10 Mm的話，將會100%卬制。試劑的保存條件在避光條件下CCK-8 試劑在4可保存一年。如果需要保存較長時間的話，推薦在-20下保存。但是CCK-8若反復解凍和冰凍將會增加空白吸收，從而影響檢測結果，若經常使用可將試劑存放在4冰箱內保存。24. 預培養后，更換培養基需要細胞計數嗎一般情況下用胰蛋白酶處理對數增長期的細胞，用血球計數盤計數，制備成一定濃度的細胞懸液即可。如果想要精密計數細胞的話，可以預培養后取培養基用血球計數盤進行計數。對于不同的細胞，靈敏度是否一樣不一樣，懸浮細胞與貼壁細胞相比較難染色。對于貼壁細胞，一般加入CCK-8培養1-4小時吸光度已經很高，但對于懸浮細胞則可能吸光度較低，可以通過延長CCK-8的加入時間或增加細胞數量來解決。26 . 懸浮細胞和貼壁細胞在數量上有何區別懸浮細胞由于染色比較困那，一般需要增加細胞數量和延長培養時間。貼壁細胞染色比較容易，若細胞數量過大，有時吸光度會超過酶標儀的讀數。27 . 應該每次做標準曲線嗎建議每次做。雖然細胞是一樣的，但是細胞的狀態不一定一樣，對于狀態不一樣的細胞，建議每次做標準曲線。如果試劑的批號不一樣，靈敏度可能會有輕微的差異，對于不同的批號建議分別做標準曲線。28 .有時在藥物作用情況下，細胞已經死亡，但是脫氫酶的