1、精選優質文檔-傾情為你奉上主題：液相色譜進階講座之梯度洗脫簡介：通過實例詳細介紹“梯度洗脫”的意義、應用領域、操作方法以及優化，相信能夠使廣大網友的液相色譜技術有一些嶄新的提高歡迎參與交流和討論梯度洗脫gradient elution1 簡介通常情況下，液相色譜操作中的流動相組成和比例是恒定的，這種洗脫化合物的方式被稱為等度洗脫；但是為了改善分析結果，某些操作需要連續改變流動相中各溶劑組分的比例以連續改變流動相的極性，使每個分析組分都有合適的容量因子k，并使樣品種的所有組分可在最短時間內實現最佳分離，這種洗脫方式稱為梯度洗脫。2 梯度洗脫的應用梯度洗脫可在下列情形中發揮重要作用：A 在等度下具

2、有較寬k值的多種樣品分析。B 大分子樣品分析。C 樣品含有強保留的干擾物，在目標化合物出峰后設置梯度洗脫，將干擾物洗脫出來，以免其影響下一次分析。D 單組份化合物方法建立時，不知道其洗脫情況，使用梯度洗脫，找出其較優的洗脫條件。(1) 多組分分析時，這些組分往往具有很寬的k值范圍。假如使用等度洗脫，這些化合物的k值無法同時落在110之間，結果就是，無法同時得到較好的分離度、較短的分離時間、較高的響應值。圖T1、T2、T3是筆者不同條件下分析鄰苯二甲酸酯類化合物得到的色譜圖。圖T1  (等度，流動相：80%乙腈水溶液)圖T2 (等度，流動相：100%乙腈)圖T3 (梯度，0-

3、5 min，乙腈由70%上升到90%，5-10 min乙腈由90%上升到100%，10-18min，乙腈100%)其他色譜條件：色譜柱：Diamonsil C18(2)，250*4.6 mm，5 m流速：1.0 ml/min檢測器：UV254 nm1 鄰苯二甲酸二甲酯(DMP)2 鄰苯二甲酸二乙酯(DEP)3 鄰苯二甲酸二正丙酯(DPrP)4 鄰苯二甲酸丁基芐基酯(BBP)5 鄰苯二甲酸二正丁酯(DBP)6 鄰苯二甲酸二戊酯(DPP)7 鄰苯二甲酸二環己酯(DCHP)8 鄰苯二甲酸二己酯(DHP)9 鄰苯二甲酸(2-乙基己基)酯(DEHP)三種洗脫方式對比條件最小分離度分析時間靈敏度等度1(T

4、1)4100 min1-9，靈敏度逐漸降低，8和9難以檢出等度2(T2)0.811 min1-9，靈敏度逐漸降低，均較高梯度(T3)325 min1-9，靈敏度相差不大，均較高由該分析案例可知，在多組分分析時，只要能夠選出合適的梯度條件，就能夠實現“較好的分離度、較短的分離時間、較高的響應值”。(2) 樣品溶液中同時含有目標化合物和強保留化合物，目標化合物流出后使用梯度洗脫將強保留化合物洗下來，以避免強保留化合物污染色譜柱或在后續的分析中流出干擾分析。T4 某分析項目末端梯度洗脫以洗掉過剩的衍生試劑(末端梯度：39-40 min，有機相含量由38%升高到80%，保持10 min)由T4可以看出

5、，40 min左右，最晚出峰的組分已經被洗下來，然而卻把有機相在1 min內由38%升高到80%，目的就是為了洗脫衍生反應剩余的衍生試劑(50 min處的色譜峰)。前面的雜質峰為樣品基質中的強保留干擾物，末端的梯度洗脫同樣也將其洗了下來，這就避免了這些化合物在隨后的分析中緩慢流出造成的基線起伏。(3)當遇到新的化合物需要分析，我們沒有文獻可以參考，只能初步圈定分析模式(反相、正相等等)，此時確定不了等度洗脫的流動相組成和比例，只好借助梯度洗脫。3 梯度洗脫的原理(以反相色譜為例)梯度洗脫的實質就是，樣品隨梯度起點的流動相進入色譜柱入口，由于起點流動相中強洗脫溶劑B含量較低，化合物C1(保留性適

6、中)和化合物C2(保留較強)因k值較高而滯留于色譜柱入口附近(幾乎未移動)。一段時間后，B增加到一定數值，C1的k值達到足夠小(比如小于10)，其在柱中的移動速率明顯增大，并且隨著B的增加，其移動速率愈加快速，直到tC1時流出色譜柱，被檢測器檢測到并被記錄成色譜峰C1，tC1雖然比等度時的保留時間長很多，但C1的的平均k值卻很小，因而色譜峰并未展寬，靈敏度仍處于較高水平。B持續增加，在隨后的某個時間點，C2的k值也降到10以下，C2的移動速率也開始變快，以與C1類似的方式于tC2被洗脫出色譜柱，其平均k值同樣很小，色譜峰亦未展寬，靈敏度處于較高水平。T5 梯度洗脫過程中的峰遷移黑色虛線代表B比

7、例的變化(對應左側上方縱軸)紅色曲線代表化合物k值隨流動相改變而發生的變化(對應右側縱軸)綠色曲線代表化合物化合物在柱中的位置變化(對應左側下方縱軸)紫色曲線為色譜圖4 梯度分離的建立梯度洗脫可以按下列步驟建立;A 選擇初始條件：色譜柱(類型和規格)、流動相組成、流速、柱溫等等B 根據A的分析結果升高起始流動相中的B%并降低結束流動相中的B%，以去除色譜圖中第一個峰出現前的和最后一個峰出現后的無意義時間C 當峰分離較差或運行時間過長的時候，應通過調整強洗脫溶劑B、B升高速率或使用分段梯度等方式予以解決D 考察不同儀器對梯度分離的影響。(1)選擇梯度條件流動相：選擇一種強洗脫溶劑和一種弱洗脫溶劑

8、，反相中常用強洗脫溶劑為乙腈和甲醇，弱洗脫溶劑為水,(由于反相中分離的化合物許多具有解離性，所以水相往往有酸、緩沖鹽等，這些不在本講座討論范圍以內，本講座提到的水相可能包括純水、緩沖鹽水溶液等，具體事例會明確寫出)。正相中常用的強洗脫溶劑為甲基叔丁基醚、異丙醇等，弱洗脫溶劑為正己烷。流速：對于4.6 mm內徑的色譜柱一般把流速設定為1.01.5 ml/min，其他內徑的色譜柱可以以此標準進行換算；柱溫：如有柱溫箱，設定柱溫3545 ºC為宜；初始變化速率：可以按下面的公式計算確定F為流速，單位為ml/min；Vm為色譜柱死體積，單位為ml；k*為期望的平均保留因子；%B為強洗脫溶劑的

9、變動值；tG為梯度時間，單位為min。該公式適用于相對分子量處于50500之間的化合物。對于150*4.6 mm的色譜柱，Vm約為1.2 ml；流速通常設定為1.0 ml/min；k*為5是比較好的選擇；因此%B/tG應為3.3，也就是B的改變速率設定為3.3%是適宜的，當梯度范圍為5%-100%，梯度時間可以設為29 min。梯度范圍：為避免峰遺漏，初始梯度范圍最好設置為強洗脫溶劑變動范圍為5%-100%，在反相中可以把乙腈的變動范圍設置在5%-100%，如果是能夠耐受純水的色譜柱，也可以設定在0%-100%。梯度形狀：在初始梯度實驗中，梯度可設置成線性(不分段)，在后續的調整中則可以設置分

10、段梯度，每一段梯度的B變動斜率存在差別。(2)調整強洗脫溶劑B、梯度變化速率或使用分段梯度等方式以優化梯度條件流動相對選擇性起著至關重要的作用，流動相組成或比例的改變均會顯著改變分離度，在梯度中亦然。反相模式梯度的初試中，強洗脫溶劑往往選擇乙腈，但乙腈只是在某些項目中具有較好的選擇性，而另一些項目甲醇或許更合適。乙腈、甲醇洗脫能力相近，但二者的選擇性則具有互補性。T6、T7、T8是PITC柱前衍生-反相液相色譜分析18種氨基酸的色譜圖。T6以乙腈作為強洗脫溶劑，丙氨酸和脯氨酸(7和8)分離度不足1.5；T7以甲醇作為強洗脫溶劑，9后面的組分分離很差。上述表明，甲醇對前面一組峰的分離較好，兒乙腈

11、則更適合后面一組峰，因此筆者把甲醇乙腈混合液作為強洗脫溶劑，T8證明這種混合溶劑的確能夠將18種天然氨基酸、內標物正亮氨酸以及NH3的的分離度達到2.0以上。T6 B為80%乙腈水溶液T7 B為80%甲醇水溶液T8 B為甲醇：乙腈：水=20:60:20其他色譜條件色譜柱：Diamonsil AAA氨基酸分析柱，250*4.6 mm，5 m；流動相B：見譜圖上方的描述流動相A：0.05 mol/L乙酸鈉水溶液(pH=6.5)流速：1.0 ml/min檢測器：UV 254 nm柱溫： 35 攝氏度具體化合物：1 Asp(天冬氨酸)；2 Glu(谷氨酸)；3 Ser(絲氨酸)；4 Gly(甘氨酸)；

12、5 His(組氨酸)；6 Arg(精氨酸)；7 Thr(蘇氨酸)；8 Ala(丙氨酸)；9 Pro(脯氨酸)；10 NH3；11 Tyr(酪氨酸)；12 Val(纈氨酸)；13 Met(蛋氨酸)；14 Cys(胱氨酸)；15 Ile(異亮氨酸)；16 Leu(亮氨酸)；17 Nle(正亮氨酸)；18 Phe(苯丙氨酸)；19 Trp(色氨酸)；20 Lys(賴氨酸)化合物列表與T8上的峰號嚴格對應。梯度變化速率梯度變化速率與平均保留因子k*是成反比關系的，梯度變化速率降低，k*值增加，并會產生如下結果：其一，各組分間的分離度R提高；其二，色譜峰的區域寬度增加，靈敏度下降；其三，分析時間延長。第

13、一點是積極的，第二、第三點是消極的。所以應在分離度能滿足要求的前提下，控制梯度變化速率不要過低。下面是梯度變化速率的影響：測試項目為15種農藥，唯一變量為梯度變化速率。T9  甲醇變化速率20%/min，k*=1T10  甲醇變化速率5%/min，k*=4T11  甲醇變化速率1%/min，k*=15其他色譜條件色譜柱：C18,250*4.6 mm，5 m流動相：甲醇，水流速：1.7 ml/min柱溫：室溫由T9、T10、T11可知，隨著強洗脫溶劑變化速率降低，各組分的分離度逐漸增大，分析時間也逐漸延長。如果改變溶劑、調整梯度變化速率

14、仍不能較好分離則需要改成非線性梯度。下面是偶氮釋放的24種芳香胺分析：T12  偶氮釋放的24種芳香胺分析的梯度設置B為甲醇，A為0.005 mol/L 磷酸二氫銨+0.005mol/L磷酸氫二鈉水溶液T14  色譜圖結合梯度和色譜圖可知，1-6是由第一段梯度(藍色虛線)洗脫下來，B升高速率為0.5%；7-16由第二段梯度(粉色虛線)洗脫下來，B升高速率為0.27%，色譜峰寬度較大；17-24由第三段梯度(綠色虛線)洗脫下來，B升高速率為1.85%，因而峰形最為尖銳。(3) 不同儀器對梯度分析結果的影響以及消除影響的辦法與等度分析不同，梯度分析時，色譜柱

15、入口的流動相狀態并不能與梯度曲線上的流動相狀態在時間上準確對應。比如，0 min流動相比例已經開始變化了，這種變化首先由泵或比例閥做出動作，而此刻柱入口處的流動相組成仍是初始流動相，變化的流動相穿過泵或比例閥到柱頭之間的空間后才能傳達到柱入口，所以色譜柱入口的流動相狀態始終滯后于時間程序上的流動相狀態。滯后時間tD=VD/F，VD是泵或比例閥到柱頭之間的體積，F為體積流速。不論是高壓梯度還是低壓梯度，滯后體積通常處于28 mL之間，滯后體積的不同會導致下列現象：其一，在不同款式儀器上使用相同梯度，保留時間會發生變化；其二，在一種款式的儀器上開發的梯度洗脫方法換到另一款儀器上，可能會出現分離度下降、峰位置變化等現象可用用下面的辦法消除上述不利影響：在A儀器上(VD=V1)開發梯度方法，在開發的梯度程序前預先加入5 min等度洗脫(比例與初始流動相比例相同)，并確定這5 min的等度為影響分離，這就可以作為最終的梯度條件；等換到B儀器上(VD=V2)，若V2=V1，梯度程序不需改變；若V2大于V1，那么應把前面的等度時間調小，減小值應為(V 2-V1)/F；若V2小于V1，那么應把前面的等度時間調大，增加值應為(V1-V2)/F。說到這里了，您可能會問我該怎