1、第4頁 共8頁1網sample loaded onto gelby pipetteFigure 8-14 part 1 of 2. Molecular Biology af ths Cell, 4th Edition.凝膠模子由3部分組成：一個壓制成“口一”形的橡膠帶;兩塊長短不等 玻璃板；樣品槽模板。膠帶的內側有兩條凹槽，可將兩塊相應大小的玻璃板嵌入 槽內。玻璃板之間形成一個0.52mms的間隙，待制膠時，將玻璃板洗凈、晾 干、嵌入膠帶凹槽中。將長玻璃板下沿與膠帶框底之間保持12 mm距離，使此端的凝膠與一側的電極槽相通，而短玻璃板的下測則插入橡膠框的底槽內，由此便形成一個“夾心”凝膠腔。把

2、上述好的凝膠腔置于電泳槽內，用長螺絲將兩個實驗十聚丙烯酰胺凝膠電泳分離生物大分子I聚丙烯酰胺凝膠電泳分離血清蛋白【目的和要求】通過本實驗學習垂直板電泳技術一一聚丙烯酰胺凝膠電泳的操作。【基本原理】聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylaminde gel electrophoresis , PAGE 可 分為連續的和不連續的兩類，前者指整個電泳系統中所用緩沖液，pH值和凝膠網孔都是相同的，后者是指在電泳系統中采用了兩種或兩種以上的緩沖液，pH值和孔徑，不連續電泳能使稀的樣品在電泳過程中濃縮成層，從而提高分辨能力。如果在聚丙烯酰胺膠不連續系統， 堿性緩沖體系中，分離血清蛋白質，由于具有 濃縮、電

3、荷、分子篩三種效應，所以分離效果好，分辨率高，血清用紙電泳只能 分出57個成分，用聚丙烯酰胺凝膠不連續電泳可分出 30多個條帶清晰的成分。【操作方法】1.凝膠的制備(1)不連續系統狀凝的制備步驟裝板:方法a：半槽固定在一起。在擰緊螺絲時，要按照一定的順序逐個擰緊，均勻用力，不能 用力過猛或先擰緊一個后再擰另一個， 否則電泳槽受力不均會使玻璃板壓碎， 電 泳槽損壞，造成漏膠、滲液等現象。方法b:灌膠前，先將玻璃片洗凈、晾干、嵌入膠事凹槽中。長玻璃片下沿與膠帶框底之間保持的一縫隙，以使此端的凝膠與一側的電極槽相通； 而短玻璃片的下沿 則插入橡膠框的底槽內。將已插好玻璃片的凝膠模子置于仰放的上貯槽上

4、，短玻 玻璃片應面對一定順逐個序擰緊，均勻用力。將裝好的電泳裝置垂直旋置，在長玻璃片下端與硅膠樞交界的縫隙內加入用電極緩沖溶液配制的1%瓊脂、溶液,待其凝固后，即堵住凝膠模板下面的窄縫（通電時又可作為鹽橋）raw-i夾心式垂直板型電泳槽示意圖I-導線接頭上下貯槽3.U形橡膠框%樣品槽模板5,固定螺絲6.上貯槽7.冷凝系統圖14-2靛膠模子示意圖%樣時槽模板2,長玻需片 3.意玻璃片4。形硅膠框配膠：將電泳槽、凝膠模子用成一體的垂直板型電泳裝置，垂直放置在水 平臺面上，準備灌注膠液。根據所測蛋白質相對分子質量范圍， 選擇某一合適的 分離膠濃度，按照表1所列的試劑用量和加樣順序配制某一合適的凝膠。

5、凝膠液灌注和聚合：灌注凝膠液前先用滴管吸取少量的用電極緩沖液配制 的1.5%瓊脂（1%O旨糖）溶液，灌入凝膠模板底部（長玻璃板處側，下沿凹形 小槽內），其液面高度約為0.51.0cm （注意：要使瓊脂液面平整）。待瓊脂凝 周后，堵住凝膠模下面的窄縫（通過電時又可作為鹽橋）。將所配制的凝膠液沿 著凝膠腔的長玻璃板的內緩緩倒入或用滴管滴入，小心不要產生氣泡。將膠液加到距短玻璃板上沿23cm處為止。凝膠液的注入和聚合i.分離膠膠液的注入和聚合方法是：用一注射器通過注射針頭沿玻璃管內壁 緩慢注入0.51cm高度的蒸儲水（或正丁醇）進行水封。水封的目的是隔絕空 氣中的氧，并有消除凝膠柱表面彎月面，使凝膠

6、柱頂部的表面平坦。水封切忌注 入蒸儲水時呈滴狀垂直下落，否則會使用頂部的凝膠濃度變稀，從而改變預定的 凝膠孔徑，并造成凝膠表面不平坦。水層封好后，靜置凝膠液進行聚合反應，聚合時溫度要與電泳時溫度相同。 正常情況下10min開始聚合，應控制在40min左右聚合完成。剛加水時有界面，后逐漸消失，等到再出現界面時，表面凝膠已經聚合，再靜置30min使聚合完成。ii.濃縮膠膠液的注入和聚合方法是：用注射器或滴管吸去分離膠膠面頂端的水封層，并用無毛邊的濾紙條吸去殘留的水液， 濾紙盡量不要接觸分離膠的膠 面。按比例混合濃縮膠（表1）,混合均勻后用滴管將凝膠加到分離膠上方，當濃 縮膠液面距短玻璃板上緣0.2

7、 cm時，把梳形樣品槽模板輕輕地插入膠液頂部。 靜 置聚合，待出現明顯界面表示聚合完成。插入樣品槽模板目的是使膠液聚合后， 在凝膠頂部形成數個相互隔開的凹槽。電泳前，將樣品液分別加在這些凹槽中。濃縮膠也可用光聚合法，即不用Ap液，代之加入11.5mL的4%g黃素溶液（4mg 核黃素溶于水中，加水到100mL。濃縮膠如用核黃素催化，應在距管 10cm處用 日光燈照，進行光聚合。注意不要使溫度上升過高。在正常情況下，照射67min 就可看到濃縮膠呈乳白色，表明聚合開始，繼續照射半小時，使聚合完全。表1不連續系統不同濃度凝膠配制用量表分離膠濃度 試劑藤、.配制15mL不同濃度的分離膠所需試劑量（mD

8、配制5mL 4麻縮膠（mD7.5%10%12%15%20%分離 膠30. 8%膠母液3.7567.510Tris-HCI (pH8.9)1.81.81.81.81.8濃縮 膠30. 8%膠母液一一一一一0.7Tris-HCI (pH6.7)一一一一一0.6310%TEMED蒸儲水0.159.20.157.80.156.80.155.30.152.80.053.4以上儲備液加入后混勻，為了去除抑制凝膠聚合的氧，AP加入之前進行抽氣處理，本實驗將此步省略并不影響實驗結果10%i硫酸錢（AP）0.20.20.20.20.20.052 .蛋白質樣樣品的處理取10仙L血清（2g/L）,力口 5L 40%

9、蔗糖、5L 0.1%澳酚藍指示劑，混勻。3 .加樣聚丙烯酰胺凝膠垂直板型電泳的加樣方法：在垂直型電泳裝置（參見圖5）的兩個“半槽”，即電極上槽和下槽內，分別加電極緩沖液，電極上槽，即柏金 絲在上方的“半槽”內加的緩沖液必須高于柏金絲。用微量注射依次在各個樣品槽內加樣，各加1015L （含蛋白質1015以g）,稀溶液可加2030L （還要根據凝膠厚度及蛋白質濃度靈活掌握）。4 .電泳上槽接負極，下槽接正極，打開電泳儀（仔細觀察正負極的變化）。對于垂直板型電泳，開始時電流控制在12mA樣品孔，太高的電流強度會造成產熱量大，使分離失效。如果高溫對樣品不利，可降低電流，延長時間，或進行有效的冷卻。對于

10、垂直板型電泳，一般樣品進入濃縮膠前電流控制在 1520mA持續 大約3060min；待樣品進入分離膠后，將電流調到2030mA保持是電流強度 不變。待指示染料遷移至下沿約 0.51 cm處停止電泳，需34h。5染色電泳結合后，將兩塊玻璃板剝開，將膠取出入入平皿中，加入固定液固定30min。然后棄去固定液，加入染色液，染色 10min。6脫色染色完畢，傾出染色液，加入脫色液。一天換23次脫色液，直至凝的藍黑鈀背景褪去、蛋白質帶清晰為止。脫色時間一般約需一晝夜（注意：與上述兩種染色液相對應，也有兩種脫色液）。7繪畫【注意事項】1凝膠濃度的選擇根據所分離蛋白質的相對分子質量范圍選擇最適凝膠濃度，5%

11、的凝膠最適于分離蛋白質的相對分子質量范圍是 25000200000, 10%勺凝膠最適于分離蛋白 質的相對分子質量范圍是1000070000, 3.33%的凝膠可用于分離相對分子質量 更高的蛋白質。2凝膠聚合過程中過硫酸銨的作用在凝膠的催化聚合過程中，凝膠的聚合作用通常是使用通常是使用能提供自由基（ free radicals ）的一些催化氧化- 還原體系（catalyst-redox systems ）來完成的。例如，過硫酸錢-四甲基乙二胺（TEMED核黃素-TEMED過硫酸錢 -3- 二甲基氨基丙腈（DMAP）N。本實驗采用的體系是過硫酸銨-四甲基乙二胺，以它為例，化學聚合的作用是這樣進行

12、的：由于TEMEDE堿基催化過硫酸錢，使其形成自由氧基。當（NH 2SO8 （過硫酸錢）溶解于水中時，形成自由基（SQ2-2SO-）,這些自由基與內稀 酰接觸，激活單體（丙烯酰胺）而形成單體長鏈。與此同時，由于交聯劑Bis的存在，使長鏈與長鏈彼此交聯形成凝膠。由于過硫酸錢（A?在凝膠的聚合過程中起著重要的作用，所以在配制AP時應注意以下幾個問題：（ 1）最好用近期生產的過硫酸銨，否則可先將表面一層去掉，盡量取下層稱量，以防被氧化失效。（ 2）當放入水中時，要聽到有輕微的拍拍響氣。（ 3） 臨用前配制，盛于棕色瓶中，并存放在冰箱里，使用期不超過一星期。【材料與試劑】1實驗材料：動物血清2實驗試劑

13、（ 1） 30.8%膠母液：稱取30g 丙稀酰胺、0.8gN,N -甲叉雙丙稀酰胺，加 少量蒸儲水溶解后定容至100mL過濾，4c保存。（ 2） pH8.9 分離膠緩沖液：取36.6g Tris ，加少量蒸餾水溶解。用1mol/L鹽酸調節pH至8.9 （約48ml）后，定容至100mL（ 3） pH6.7 濃縮膠緩沖液：取6.0g Tris ，加少量蒸餾水溶解。用1mol/L鹽酸調節pH至6.7 （約48mL后，定容至100mL（ 4） 1%（WM TEME解液：取 ImLTEMEDN, N, N', N'-四甲基乙二胺）， 加蒸儲水稀釋至100mL置棕色瓶中，4c保存。（ 5

14、） 10% （WM 過硫酸錢溶液：稱取過硫酸錢（NH） 2S2O （簡稱AP） lg , 溶于10mL蒸儲水中。臨用前配制。（6）電泳緩沖液（pH8.3）:取Tris 6g ,甘氨酸28.8g,溶解，用蒸儲水稀 釋至1L。用時稀釋10倍。（ 7） 40%蔗糖溶液（ 8） 0.1%溴酚藍指示劑（9）固定液：454mL 50%P醇水?§液和46mL冰乙酸。（10）氨基黑10B染色液：取1g氨基黑10B染料，用7% （V/V）乙酸溶解，稀釋至1L。（ 9） 脫色液：酸-甲醇-水脫色液：取冰乙酸75mL甲醇50mL加蒸儲水875mL 7% （V/V）乙酸脫色液：取冰乙酸 35mL加蒸儲水46

15、5mL【實驗器材】垂直板型電泳槽電泳儀（電壓 300600V,電流50100mA）微量注射器（50L或100NL）白瓷盤【思考題】1 40%蔗糖和0.1%溴酚藍的作用是什么？2本實驗是否需在低溫下進行？3電泳過程中正負極發生什么變化？4產生實驗誤差的原因可能是什么？根據你的實驗進行分析。第 6頁 共 8頁n聚丙烯酰胺凝膠電泳分離核糖核酸【目的和要求】掌握聚丙烯酰胺凝膠電泳的原理及使用范圍和操作技術，包括制膠、灌膠、 加樣、剝膠及染色等。【基本原理】隨著蛋白質分離技術的發展，人們已將聚丙烯酰胺凝膠電泳引用到核酸研究 上。使用2.5 %的聚丙烯酰胺凝膠電泳，可以依次將4s tRNA 5sRNA m

16、RN及16、 18、23、26s的rRN協開。電泳分離后，再用次甲基藍染色。由于4s的tRNAS5sRNA 分子量較小，當電泳時間太長或膠條太短時，很易泳出膠條之外，如果需要對它 們專門研究，應換用5%的聚丙烯酰胺凝膠。對于分子量較大的樣品，如大分子核酸、病毒等一般可采用膠中孔徑較大的 瓊脂糖凝膠進行電泳分離。【操作方法】1、聚丙烯酰胺凝膠制備（1）裝板：先將玻璃板和Imrffi條徹底洗凈、晾干 長玻璃和短玻璃之間兩 測放入Imrffi條，把長玻璃和短玻璃及墊條對齊，用透明膠帶密封兩測及底邊。（2）配膠（2.4%） 1:凝膠灌注和聚合 取4ml制膠貯存液（15%丙烯酰 胺-7.5 %雙丙烯酰胺

17、混合液 試劑1） , 12.27ml水及8.33ml 3Eg沖液（試劑2） 混勻，放在真空于操器中抽去制膠貯存液中的空氣，待液體沸騰30秒后，取出，加入0.2ml 10%TEMED液和0.2ml 10 %過硫酸俊溶液，再混勻。立即將此液 灌到已封閉的玻璃板間，使玻璃板與平面成45 0角放置，后再小心地加上3-5mm 高度的水層覆蓋在膠的表面。自加入過硫酸俊起，到水封為止，全部操作應不超 過20min。室溫下任其自然聚合，當天使用。該膠板也可在室溫下放置過夜后使制備5%膠的步驟，除去應取8.33ml制膠貯存液，7.94ml水及8.33ml 3E 及緩沖液外，以下各步皆同上，只是因5%膠更易聚合，

18、所以動作應更迅速。5% 膠柱應于當日制作，當日使用（tRNAf此膠中每小時泳動2cm）。2 、加樣：用濾紙條吸去膠柱上面的覆蓋水層，將膠板的透明膠帶取下，固定于電泳槽中，向槽中灌入電極緩沖液（試劑 3） o取10山樣品溶液，再加入2山0.2g/L的澳酚藍指示劑，混勻后，用微量注 射器將含有指示劑的樣品蔗糖溶液小心地轉移，加到膠板頂端的加樣槽中。取已知的樣品作為標準，與未知樣品一起泳動，用以幫助鑒定未知樣品分子量大小。若膠太軟，不易操作，可加入 0.5%瓊脂糖。3 、電泳：樣品加入后，上槽接負極，下槽接正極，打開電流儀進電泳。電泳條件：10 15V/cm,本實驗所需電壓為60-100V。澳酚藍指示劑區帶移 動到距膠板下端約l厘米處，停止電泳。4 、染色與固定：電泳結束后，將兩塊玻璃板剝開，小心將膠取出放入培養皿， 加入10ml 1M昔酸固定20min,再放入次甲