1、生物技術(shù)虛擬實(shí)驗(yàn)AMY1B蛋白的虛擬克隆表達(dá)及純化學(xué) 院：生命科學(xué)學(xué)院專業(yè)班級(jí)：生物技術(shù)131班學(xué) 號(hào)：2013013851姓 名：薛萌萌指導(dǎo)教師：文建雷1. AMY1B蛋白介紹amylase，Amy,AMS淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶類總稱，一般作用于可溶性淀粉、直鏈淀粉、糖元等1，4-葡聚糖，水解1，4-糖苷鍵的酶。根據(jù)酶水解產(chǎn)物異構(gòu)類型的不同可分為-淀粉酶（EC3211）與-淀粉酶（EC3212）。-淀粉酶廣泛分布于動(dòng)物（唾液、胰臟等）、植物（麥芽、山萮菜）及微生物。微生物的酶幾乎都是分泌性的。用作果汁加工中的淀粉分解和提高過濾速度以及蔬菜加工、糖漿制造、葡萄糖等加工制造。通常通過淀粉酶催

2、化水解織物上的淀粉漿料，由于淀粉酶的高效性及專一性，酶退漿的退漿率高，退漿快，污染少，產(chǎn)品比酸法、堿法更柔軟，且不損傷纖維。淀粉酶的種類很多，根據(jù)織物不同，設(shè)備組合不同，工藝流程也不同，目前所用的退漿方法有浸漬法、堆置法、卷染法、連續(xù)洗等，由于淀粉酶退漿機(jī)械作用小，水的用量少，可以在低溫條件下達(dá)到退漿效果，具有鮮明的環(huán)保特色。本實(shí)驗(yàn)通過對(duì)AMY1B基因進(jìn)行虛擬表達(dá)載體的選擇、分析和構(gòu)建，最終完善AMY1B蛋白的提取分離純化，獲得AMY1B蛋白2.實(shí)驗(yàn)流程從NCBI獲取AMY1B基因序列從AddGene獲得合適載體用Vector NTI軟件導(dǎo)入目的基因序列和表達(dá)載體序列目的基因與載體酶切位點(diǎn)分析

3、目的基因引物設(shè)計(jì)構(gòu)建表達(dá)載體轉(zhuǎn)化AMY1B蛋白誘導(dǎo)表達(dá)及純化3.實(shí)驗(yàn)過程3.1從NCBI獲取AMY1B基因序列進(jìn)入NCBI網(wǎng)站主頁，進(jìn)行目的基因搜索。限定數(shù)據(jù)庫為“Nucleotide”，搜索框中輸入AMY1B，如圖1：圖1綜合考慮片段大小，物種來源等因素，選擇第2條詞條，點(diǎn)擊進(jìn)入Genbank頁面。查看基因的詳細(xì)信息，如圖2：圖2在Send的下拉菜單中做如下選擇，如下圖。點(diǎn)擊Create File，待屏幕下方出現(xiàn)文件下載提示時(shí)，進(jìn)行文件的保存。文件將以txt形式儲(chǔ)存，獲得目的基因的已知信息。所下載基因?yàn)椋夯? >gi|34557|emb|X54559.1| Homo sapiens

4、mRNA for met proto-oncogene圖33.2載體的選擇本實(shí)驗(yàn)選用原核表達(dá)載體，原核表達(dá)載體調(diào)控原件包括啟動(dòng)子、SD序列、終止子。在網(wǎng)站的搜索欄中輸入pFastBac dual查找相關(guān)載體，得到很多結(jié)果。由于結(jié)果較多不利于查找，故按照以下條件進(jìn)行篩選（圖6）。圖4得到10條結(jié)果，選擇酶切位點(diǎn)比較多的載體作為本實(shí)驗(yàn)的載體。點(diǎn)擊得到其具體信息如下圖8所示：圖5同時(shí)復(fù)制序列到文本文件中保存序列信息，留作備用。3.3目的基因與載體酶切位點(diǎn)分析3.3.1利用Vector NTI軟件導(dǎo)入目的基因序列和表達(dá)載體序列打開vector NTI，點(diǎn)擊，在

5、生成頁面點(diǎn)擊，將名稱相應(yīng)的名字，再點(diǎn)擊，在general欄中填寫序列名稱圖6在DNA/RNA Molecule欄中選擇序列類型，在Sequence and Maps中點(diǎn)擊復(fù)制序列信息，依次點(diǎn)擊彈出的界面上的，再點(diǎn)擊確定。依次錄入AMY1B序列信息和pGEX6P1-HA-MEK1載體序列信息。最終結(jié)果如下：圖7點(diǎn)擊進(jìn)入程序界面，點(diǎn)擊open在Database DNARNA窗口下以選擇相應(yīng)的核酸；點(diǎn)擊OK，在右上角即可見序列信息及酶切圖譜，目的基因與載體的的酶切圖譜如下（圖12）：圖8 目的基因酶切圖譜圖9 載體酶切圖譜3.3.2酶切位點(diǎn)分析在導(dǎo)入的載體基因序列分析的頁面打開Analyses選項(xiàng)，

6、選擇Restriction Analyses下的Restriction Sites，見圖14、15。圖10圖11先選中remove all，再添加我們所關(guān)心的多個(gè)酶切位點(diǎn)，主頁面左框中出現(xiàn)酶切文件。圖12為目的基因加酶切位點(diǎn)的原則是：該酶切位點(diǎn)出現(xiàn)在載體的多克隆位點(diǎn)上并且不出現(xiàn)在目的基因序列中，保證經(jīng)酶切連接可以構(gòu)建完整的表達(dá)載體，同時(shí)保證目的基因的完整性。除去目的基因中包含的酶切位點(diǎn)，以及載體自身包含的多個(gè)同一酶切位點(diǎn)，所以，這里我們所選的關(guān)心的酶切位點(diǎn)應(yīng)該是Hind和Xma。添加酶切位點(diǎn)后，在左側(cè)可以顯示生成的如下（圖17）酶切文件：圖13目的基因中沒有Hind和Xma這兩個(gè)酶切位點(diǎn)，在設(shè)

7、計(jì)引物時(shí)，分別加在目的基因的5和3端。這樣對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行酶切時(shí)不會(huì)切到目的基因。在引物設(shè)計(jì)中已將這兩個(gè)酶切位點(diǎn)加在了引物上。將PCR產(chǎn)物和載體進(jìn)行雙酶切，便可以連接。3.4利用NIT軟件設(shè)計(jì)PCR引物3.4.1引物設(shè)計(jì)原則引物與模板的序列要緊密互補(bǔ);其次引物與引物之間避免形成穩(wěn)定的二聚體或發(fā)夾結(jié)構(gòu);再次引物不能在模板的非目的位點(diǎn)引發(fā)DNA聚合反應(yīng)。具體要求：引物的長度一般為15-30bp，常用的是18-25bp；引物序列在模板內(nèi)相似性應(yīng)當(dāng)較低；引物序列的GC含量一般為40-60%；引物所對(duì)應(yīng)模板位置序列的Tm值在72左右可使復(fù)性條件最佳；3端G值較低（絕對(duì)值不超過9）；對(duì)引物的修飾一般是在5

8、端增加酶切位點(diǎn)等。上面提到了引物設(shè)計(jì)的原則，但是當(dāng)引物有特殊要求時(shí)，也許程序設(shè)計(jì)的是嚴(yán)格符合上述要求的最優(yōu)結(jié)果，但并不符合實(shí)際需要，這時(shí)我們需要在這些條件間做權(quán)衡。目的基因序列已在NCBI上查找到，克隆PCR產(chǎn)物的方法之一，是在PCR產(chǎn)物兩端設(shè)計(jì)一定的限制酶切位點(diǎn)，經(jīng)酶切后克隆至用相同酶切的載體中。但實(shí)驗(yàn)證明，大多數(shù)限制酶對(duì)裸露的酶切位點(diǎn)不能切斷。必須在酶切位點(diǎn)旁邊加上一個(gè)至幾個(gè)保護(hù)堿基，才能使所定的限制酶對(duì)其識(shí)別位點(diǎn)進(jìn)行有效切斷。經(jīng)查閱資料找出這兩種酶切位點(diǎn)的保護(hù)堿基如下圖18所示：3.4.2本次實(shí)驗(yàn)引物設(shè)計(jì)在本實(shí)驗(yàn)中采用Vector NIT設(shè)計(jì)引物，并結(jié)合手動(dòng)。在軟件中打開目的基因p53。

9、選取PCR反應(yīng)區(qū)段(全選)，點(diǎn)擊Primer Design,選擇Find PCR Primers Inside Selection，在新出現(xiàn)的頁面中填寫Region of Analysis參數(shù)。查看并根據(jù)實(shí)際需要進(jìn)行修改。這里我們選擇User-Defined Primers欄中的Sense，先來設(shè)計(jì)上游引物。輸入目的基因序列5端的13個(gè)堿基agcagtctctgatc，然后在前面加上酶切位點(diǎn)GAATTC，在酶切位點(diǎn)前加上保護(hù)堿基CCC,這樣上游引物初步設(shè)計(jì)為CCCGAATTCAGCAGTCTCTGAT。點(diǎn)擊右側(cè)的Analyse，出現(xiàn)如下引物相關(guān)的參數(shù)的界面（圖20）：圖14點(diǎn)擊Dimers &

10、amp; Hairpin loops查看引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)（圖21）：圖15在設(shè)計(jì)引物時(shí)，本應(yīng)盡量避免引物內(nèi)部形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)和引物之間形成二聚體，在本次實(shí)驗(yàn)中，權(quán)衡各種因素之后，無法避免引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu),但相對(duì)能量較高，結(jié)構(gòu)不是很穩(wěn)定，所以可以用作克隆引物。同理，設(shè)計(jì)下游引物為: GGATCCATCCGCAAAGCGGATCCCCC點(diǎn)擊Dimers & Hairpin loops查看引物二聚體和發(fā)夾結(jié)構(gòu)圖16圖17從上面二圖（圖22、圖23）可以看出下游引物設(shè)計(jì)較為合理。綜上所述，引物設(shè)計(jì)為：上游引物為：CCCGAATTCAGCAGTCTCTGAT下游引物為：GGATCCATCCG

11、CAAAGCGGATCCCCC3.5目的基因與表達(dá)載體連接先將目的基因調(diào)整方向，因?yàn)槟康幕蛑荒軓奈覀儾迦氲姆较虮磉_(dá)，所以我們需要將其反向插入，那么我們就要用軟件Vector NTI將其反過來。打開目的基因，點(diǎn)擊Edit,再點(diǎn)擊Molecule Operations，選中Make Reverse Complement，即可得到反向序列，如圖18：圖18圖19圖20圖21導(dǎo)入載體，刪除EcoR I和BamH I之間的片段，留下兩個(gè)完整的酶切位點(diǎn)。將目的基因與載體連接。此圖可粗略的說明目的基因被插入載體。但需要進(jìn)一步的驗(yàn)證，于是將目的基因、載體、重組載體進(jìn)行一個(gè)凝膠電泳分析，最終用電泳圖譜可觀察到

12、目的基因是否插入。從Gel Analysis中選中Setup a New Gel，出現(xiàn)新的對(duì)話框（圖26）：圖22參數(shù)保持默認(rèn)值，點(diǎn)擊Run。上方出現(xiàn)新的工具框，點(diǎn)擊Add Marker Lane，圖23選擇所需要的Marker。由于重組載體長度為9202bp，查詢合適的Marker，如圖24、25。本實(shí)驗(yàn)選擇500bp DNA Ladder作為實(shí)驗(yàn)的marker。圖24圖25添加所要跑膠的樣，先點(diǎn)擊Create sample，添加所要跑的樣品，點(diǎn)擊之后會(huì)出現(xiàn)以下對(duì)話框（圖26）：圖26從列表中選擇需要的樣品，并且添加酶切位點(diǎn)，依次點(diǎn)擊，將要點(diǎn)的樣添加到膠中，開始凝膠電泳分析。點(diǎn)樣順序依次為：

13、1.Marker；2.載體；3.目的基因；4.重組載體。結(jié)果如圖28：圖27圖28進(jìn)行電泳檢測(cè)，通過比對(duì)(圖29)就可以看出目的基因是否已經(jīng)插入到載體中。圖29結(jié)果分析： Marker我選擇了如圖27中所示，大小為10000多bP，但一直沒搞明白為什么Marker只有一個(gè)條帶；泳道二為載體酶切結(jié)果，由于EcoR I在載體中出現(xiàn)兩次，所以會(huì)產(chǎn)生4個(gè)條帶，我們需要的條帶應(yīng)該為5k-10k之間的兩條；泳道三為目的基因的酶切結(jié)果，由于目的基因內(nèi)部本身也存在一個(gè)EcoR I酶切位點(diǎn)，理論上應(yīng)該為兩條帶，但結(jié)果多了一條；泳道四為重組載體的鑒定，理論大小為9000bp左右，淹沒在雜帶中了。3.6 AMY1B蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)及純化3.6.AMY1B蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)將構(gòu)建好的載體轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5感受態(tài)細(xì)胞（CaCl2方法制備感受態(tài)細(xì)胞）。挑取單克隆菌落接種于LB培養(yǎng)基中，37攝氏度搖蕩過夜。轉(zhuǎn)接擴(kuò)大培養(yǎng)到理想狀態(tài)，加入終濃度為1mmolL的IPTG，37攝氏度誘導(dǎo)一定時(shí)間，AMY1B蛋白表達(dá)。3.6.2蛋白純化蛋白質(zhì)的純化步驟：1） 細(xì)胞破碎；2） 鹽析；3） 疏水層析；4） 離子交換層析；5） 凝膠過濾層析；6） SDS-PAGE電泳檢測(cè)。4.實(shí)驗(yàn)總結(jié)本次