1、第四章多壁碳納米管得血液相容性實驗得原理、方法、以及結果分析對于任何一種準備用于人體得生物材料來講,材料得生物相容性就是首先必 須考慮得問題.；生物材料如果比擬成功,至少要使發生得反響被宿主接受 ,不產 生有害作用,因此要對生物材料進行生物平安性評價,即生物學評價.那么碳納米 管材料就是否具有優良得生物相容性呢 我們做了幾項血液相容性測試,從而反 映了其生物相容性.4、1實驗所用試劑及儀器1、試劑名稱備注生產廠家白蛋白AlbSigma纖維蛋白原FibSigma免疫球蛋白IgGS i gma草酸鉀天津市瑞金特化學品瞬酸鹽緩沖液P B S北京中杉金橋生物技術二胺四乙酸S i gma甲基硅油Sigm

2、a2、儀器與耗材CO2恒溫培養箱T herm o F o r m a自動雙重純水蒸儲器上海亞榮生化儀器廠數顯恒溫水浴鍋金壇市榮華儀器制造電熱恒溫鼓風枯燥箱上海精宏設備公司微量天平Nm e ttler Tole doLD5- 2 A型低速離心機北京醫用離心機廠7 2 2分光光度計上海第三分析儀器廠Ni c o let 5700紅外光譜儀Om n i-采樣器美國T h e rm oF i sher公司液氮罐成都金鳳液氮容器公司1 0 00ml正壓/、銹鋼濾器上海醫藥工業研究院一次性濾器0、2陽1L i fe S cience s田胞計數板天津北海玻璃儀器公司細胞計數器國產25cm2 一次性培養瓶C

3、orning一次性培養板2 4孔Costa r一次性培養板9 6孔Costa r4、2蛋白吸附實驗材料外表與血液接觸后立即在材料外表吸附一層蛋白質,這一蛋白質吸附層 就是外表血栓形成得重要因素.蛋白吸附層得成份組成影響血小板在外表得黏 附,激活與釋放反響.許多研究說明纖維蛋白原、纖維連接蛋白原與球蛋白在表 面得吸附能促進血小板在外表得黏附,易形成血栓；而白蛋白在外表得吸附,不 促進血小板在外表得黏附,不易形成血栓.因此材料外表纖維蛋白原得吸附在血 栓形成中起重要作用.4.2.1蛋白質溶液得配置1取1 ml、1 00mg/m 1得白蛋白A lb溶液,參加4mlPBS緩沖液,配 置成5m 1終濃度

4、為20mg/m 1得A 1 b溶液；2 取3、09ml、3 2、4m g/ml得免疫球蛋白I gG溶液,參加 1、8 1 mlPBS緩沖液,配置成5ml終濃度為20m g/m 1得I gG溶液；3稱取100mg纖維蛋白原Fib凍干粉,溶解到5m 1 PBS緩沖液中, 配置成5ml終濃度為2 0 mg/ml得Fi b溶液.4.2.2實驗步驟1 取碳紙組、碳納米管組材料各 9片,每片0.5 c mx0.5cm大小,在材 料上方滴加3 00 M得20m g/m 1得蛋白質溶液,每種蛋白質各3片,如圖4、1 所示；碳納米管組圖4、1研究蛋白質吸附時樣品使用示意圖(2)在37 c烘箱中吸附兩小時后,吸走

5、材料外表蛋白質溶液,用 PBS溶液 沖洗2次,置于枯燥器中晾干；(3)將樣品固定在Omni采樣器上,啟動程序,設定參數掃描間隔為4cm, 掃描為次數為32,掃描范圍為6 5 0-4 0 0 0cm-1;(4)以未吸附蛋白質得空白材料為參考光譜, 對吸附有蛋白質得材料進行 掃描,利用Nicol et 57 0 0紅外光譜儀(美國Thermo公司),如圖4、2所示獲得 材料外表吸附蛋白質得紅外光譜；(5 )對獲得得紅外光譜實驗結果進行分析與處理.? 圖4、2 Ni c o 1 et 5 7 00紅外光譜儀4. 2.3實驗結果分析蛋白質得紅外光譜有多個特征吸收峰,氨基II帶(中央峰155 0 cm-

6、1)得強度與材料外表吸附得蛋白質量呈線性關系：66：0圖4、3為材料外表吸附蛋白質得紅外光譜圖.其中圖A、C、E為碳紙外表吸附蛋白質得紅外光譜,圖B、D、F為多壁碳納米管外表吸附蛋白質得紅外光譜 (1450 1750 cm1).根據碳紙與碳納米管外表吸附蛋白質得紅外光譜及根文獻：67：中得方法計算得到蛋白質吸附量結果及兩種材料外表得 Ra/f與Ra/i值列于表4、1中.0.030wave number (cm1).alecnap osbA0.0100.0090.0080.0070.0060.0050.0040.0030.0020.0010.000175017001650160015501500

7、145014001350A、碳紙外表吸附A 1 b得紅外圖譜 圖譜B、碳納米管外表吸附A 1 b得紅外0.012DabrosbA.alxecn ap osbA0.0110.0100.0090.0081750170016501600155015001450wave number (cm -1)c、碳紙外表吸附Fib得紅外圖譜0.0420.0410.0400.0390.0380.0370.0360.0350.034u-arecnaDTOSDA-alec n apo sb A0.0330.0300.0270.0240.0210.0180.0150.01217501700165016001550150

8、01450wave number (cm-1 )D、碳納米管外表吸附Fib得紅外圖譜0.0160.0140.0120.0100.0080.0060.0040.0020.0001750170016501600155015001450wave number ( cm1)1750170016501600155015001450wave number ( cm -1)E、碳紙外表吸附IgG得紅外圖譜F、碳納米管外表吸附IgG得紅外圖譜X Axis Title圖4、3材料外表吸附蛋白質得紅外光譜表4、1紅外實驗數據結果-一材料一MW CNTsAlb0、0 05 2 00、0 0520Fib0、0 00

9、97 70、008 9 3IgG0、0 0 4070、0 07 8 3Ra/f5、32 20、582Ra/i2780、664從表4、1可以瞧出這兩種材料吸附白蛋白得量就是一樣得,但碳納米管表 面吸附得F ib與IgG得量均大于碳紙.一般認為,疏水性外表吸附得蛋白質量大 于親水性外表,這與接觸角測試中碳納米管疏水性高于碳紙與本實驗得出得疏水 得碳納米管外表吸附得Fib與IgG得量均大于碳紙就是一致得.另外材料外表粗糙度與血栓得形成也有一定得關系.一般認為,材料外表吸附白蛋白可以抑制血小板粘附與血栓形成,而吸附纖維蛋白原易于使血小板粘附 外表,進而導致血小板變形聚集,繼發凝血形成.因此采用 Alb

10、與F 1 b在材料表 面得吸附量之比Ra/f及A 1 b與IgG在材料外表得吸附量之比R a/i來 預測這兩種材料得抗凝血性,Ra/f與Ra/i值得順序均為：CMWCNTs,這個結 果說明碳紙得抗凝血性可能優于碳納米管.但不能僅憑此項實驗結果來確定材料 抗凝血性得優劣,必須進行其它得測試以及更進一步得研究.因此我們還做了溶血實驗、血小板粘附實驗等,來進一步研究材料得血液相容性.4、3溶血實驗血液與合成材料接觸時會發生一系列得變化通常情況下,血漿中得蛋白分子 會瞬間吸附于材料外表,形成血漿蛋白吸附層；吸附層中得血漿蛋白會繼而激活 血液中得功能細胞.如血小板、白細胞、紅細胞等,并最終導致溶血、血桂

11、形成以及炎癥反響等其它不良后果6.此外,血漿蛋白在材料外表得非特異性吸附還 會激活人體免疫系統,引發免疫應：690因此,血漿蛋白分子在材料外表得吸附行為 就是決定材料引起生物系統何種后續響應得一個關鍵因素.但就是關于碳納米管材料對血漿蛋白分子與血液細胞作用得研究還很少見于報道.多年來,盡管研究人員一直通過各種途徑開發新型生物材料與對已有得生物 材料進行外表修飾改性,但血液相容性問題仍然存在,成為限制生物材料在血液 接觸環境中應用得關鍵問題之一.碳納米管所具備得獨特結構與化學組成使其有 可能對血液產生不同于現有生物材料得特殊作用. 本研究通過掃描電鏡S E M 觀察分析了單壁碳納米管無紡膜對血漿

12、蛋白分子得吸附行為以及對血小板得作 用,討論了這種新型單壁碳納米管無紡膜材料抑制血小板粘附與活化得可能作用 機理.溶血試驗通過試驗樣品與血液直接接觸, 測定紅細胞釋放得血紅蛋白量以檢 測樣品體外溶血得程度.材料得血液相容性評價就是材料生物學評價得重要組成 局部,在眾多得血液相容性試驗中,溶血試驗就是國內外各實驗室開展比擬多得 一項試驗,就是最常用得粗篩試驗,也被認為就是細胞毒性評價得一個補充試驗. 溶血實驗得機理在于紅細胞破壞之后會造成血紅蛋白得釋放,血紅蛋白四方量得多少能通過分光光度計測定得 OD值反響出來,因此以OD值來反映材料可溶性 成分或材料外表得溶血性能.YY/T0 1 27、1規定

13、,材料溶血率在5 %以下為符合 要求,可以認為沒有溶血作用70:4. 3. 1 材料制備陰性對照組：生理鹽水NS陽性對照組：蒸儲水H2O樣品組：碳紙C,多壁碳納米管MWCNTs,氮摻雜多壁碳納米管MWCNT s -N新鮮得稀釋抗凝兔血制備：由健康成年新西蘭兔心臟采血 20 ml,加2%草酸鉀1 ml,制備成新鮮得抗 凝兔血.取新鮮得抗凝兔血8 ml,加生理鹽水注射液10 mL4. 3.2實驗步驟陰性對照組3支三角瓶,每瓶參加生理鹽水注射液 5 ml.陽性對照組3支三角瓶,每瓶參加蒸儲水5m 1 o每個樣品組3支三角瓶,每瓶各參加5 cm2得材料,用生理鹽水注射液沖洗樣 品三次,然后參加生理鹽水

14、注射液5 ml o全部三角瓶封口后放入恒溫水浴中 37土 C保溫3 0 min；每只試管參加0、 05 m 1稀釋兔血,輕輕混勻,置 37步 C繼續保溫60 min,取出所有三角瓶待 其降至室溫；用離心機1500 r、p、m離心15 min；肉眼觀察上清液清亮,吸取上 清液移入比色皿中,用分光光度計在 545 nm波長處測定吸光度,記錄結果.圖 4、4為722分光光度計.圖4、4 722分光光度計4.3.3實驗結果分析樣品組與對照組吸光度均取3支試管得平均值.陰性對照組得吸光度應不大 于0、03,陽性對照管得吸光度應為0、 80、3,試驗成立.但在本實驗中由于 樣品數量有限,所以未能根據國標取

15、值,但實驗中根據國家標準成比例縮小取值 范圍,材料與取血量均成比例縮小,實驗所得數值與國標標準數值可以參比.溶血率應按下式計算：式中：A樣品組得吸光度B陰性對照組得吸光度C一-陽性對照組得吸光度5所示,作為陰性對照組得生a1與新鮮得抗凝血作用后,在離心管底部就是完好得紅細胞,上部就是澄清得液體照組得紅細胞,而陽,半透明得液體.三種表4、2樣品得溶血率3- 平均值溶血率0、011NS 生理鹽水, 陰性H 2 0陽性C0、0090100、014羽也對照一0、 2 420、 0 14冬0、2400、24440 6 01血照片0、016p八、 0、2420、 0 14 31、4 3%到破壞而通過破損得

16、細胞膜釋放出血紅蛋白形成了紅色傳 樣品材料得溶血測試結果良好,與陰性組得情況根本一 于可用范圍.MWCN Ts0、0 1 40、0 130、0150、0141、3%M WCNTs-N0、01 40、 01110、01 40、013r.、87%根據表4、2中得數據,繪制成圖4、6得溶血率柱狀圖,可以很明顯得比擬 出三種材料得溶血率大小關系.paper溶血率圖4、6溶血率柱狀圖表4、2為樣品溶血率得計算結果,結合圖4、6可以瞧出三種樣品得溶血率 順序為:C MWCNT s MWC NTsN,但都小于標準值 5%,實驗過程中我 們瞧到,放有三種材料得離心管底部就是完好得紅細胞,上部就是澄清得液體 與

17、圖4.3a陰性對照組情況相同,那么可認為材料良好,沒有溶血性,對紅細胞 沒有破壞.我們能預測碳納米管與摻氮碳納米管可能具有更為優秀得血液相容 性,因此我們進行了進一步得實驗研究.4、4血小板粘附實驗血小板(blo od pl a te 1 e t)就是哺乳動物血液中得有形成分之一. 血小板 在長期內被瞧作就是血液中得無功能得細胞碎片.血小板具有特定得形態結構與生化組成,在止血、傷口愈合、炎癥反響、血栓形成及器官移植排斥等生理與病 理過程中有重要作用.當血管破損時,血小板受到損傷部位激活因素刺激出現血小板得聚集,成為血小板凝塊,起到初級止血作用,接著血小板又經過復雜得變化產生凝血酶,使鄰近血漿中

18、得纖維蛋白原變為纖維蛋白,互相交織得纖維蛋白使血小板凝塊與血 細胞纏結成血凝塊,即血栓.同時血小板得突起伸入纖維蛋白網內,隨著血小板微絲(肌動蛋白)與肌球蛋白得收縮,使血凝塊收縮,血栓變得更堅實,能更有效地起止血作用.隨著生物與醫學得開展,細胞得粘附成為細胞生物學中得重要課題之一.研 究血小板粘附、聚集可望使這一課題取得新進展.血小板粘附實驗就是血液相容 性評價得重要實驗,從而為國家血液相容性評價標準化提供可靠得依據7：4.4 0 1 材料制備大量相關得學術研究說明甲基硅油在微相結構外表性能方面具有良好得抗凝血性能,而玻璃得抗凝血性能較差.因此,甲基硅油與玻璃常用作血液相容性 試驗得參比對照.

19、本研究采用甲基硅油與玻璃兩種材料作為驗證血液相容性優劣 得參比對照.碳紙組：將碳紙在清水中浸泡4 -5h,以去除外表附著得非晶態碳,裁成1 1 c m2大小得正方形,備用.碳納米管組：將碳納米管在清水中浸泡4-5h,以去除外表附著得非晶態碳, 裁成1 1cm2大小得正方形,備用.摻氮碳納米管組：將摻氮碳納米管在清水中浸泡 4-5h,以去除外表附著得非 晶態碳,裁成11 cm2大小得正方形,備用.陰性對照組：直彳5 0、5、MM得玻璃球外表涂以2%得甲基硅油,自然枯燥 后備用.陽性對照組：直徑0、5、MM得玻璃球.4.4.2實驗步驟在24孔板中,取1X1 cm2得碳紙與碳納米管材料各 2片,分別

20、放入4個 孔中.陰性對照組2個孔,各放涂有2%甲基硅油得直徑為0.5mm得玻璃球14 0個.陽性對照組2個孔,各放直徑為0.5mm得玻璃球140個.取健康成年新西蘭兔心臟血,與樣品接觸1 560秒鐘,將通過材料得血液 與EDTA (1%)以9: 1比例混勻.再用血小板保存液稀釋抗凝血. 并在鏡下做血 小板計數.取出材料對外表進行掃描電鏡分析.4.4.3實驗結果分析血小板(platelet)就是存在于循環系統中得無核盤狀細胞,直徑多為34仙俱 在血液中得含量約為0、3%,粘附于外表并聚集成血栓子以減少出血.它能通過形成血小板栓抑制流血,通過催化凝血反響使血小板栓穩定, 導致血栓.血小板 粘附試驗

21、就是評價生物材料抗凝血性能得方法之一72.甲基硅油就是一種抗凝血性能較好得材料,而玻璃球就是抗凝血水平就很差,因此本文就分別以它們作為 陰、陽性參照物.與正常對照計數算出樣品血小板得黏附率.式中：A- 抗凝血中得血小板數；B 與材料作用完之后得抗凝血中得血小板數.表4、3樣品得血小板數及血小板粘附率12血小板平均數血小板粘附率空白326369347、5-硅27 12 912 8 119、14%玻璃7 37272、579、13%C25228426822、87%MWCNTs-N28 3276279、519、57%MWCNT s31932 83 2 3、56、9%甲基硅油就是一種抗凝血性能較好得材料,而玻璃球就是抗凝血水平就很 差,分別以它們作為陰、陽性參照物.表 4、3為樣品說明粘附血小板數及血小 板粘附率得計算結果,可以瞧出三種材料得血小板粘附率順序為：CMWCNTs-N MWCN Ts, 一般認為疏水性外表可以抑制血小板得粘附與血栓得形 成.因此,實驗結果說明碳納米管與摻氮碳納米管外表得疏水性高于碳紙,而掃描 電鏡結果顯示碳納米管得粗糙度顯著大于碳紙,這都與實驗過程中瞧到MWCNTs接觸血液初期根本不吸附得現象一致.但三種材料卻都與陰性對照組得數值 接近且遠低于陽性對照組并接近于陰性對照組 ,均處于可使用范圍.圖4、7碳紙外表血小板粘附情況20 0