1、人類基因組方案的完成, 標志著科學已進入后基因組時代.雖然大量的基因序列得到闡明,但是生物大分子如何從這些基因轉錄、譯、加工、折疊、組裝,形成有功能的結構單 元,尚需進一步的研究. 后基因組時代人類面臨的一個挑戰是解析基因產物一蛋白質的空間結構,建立結構基因組學,并在原子水平上解釋核酸一蛋白,蛋白一蛋白之間的相互作用,從而說明由這些生物大分子和復合物所行使的生物學功能.在此過程中,結構生物學在其中扮演著重要角色.對生物大分子結構的解析,不僅具有深遠的根底意義,而且具有廣闊的應用前景.通過對核酸、蛋白質及其復合物的結構解析,人們對它們的功能的理解更加透徹, 就可以根據他們發揮功能的結構根底有針對

2、性地進行藥物設計,基因改造,疫苗研制開發, 甚至人工構建蛋白質等工作,從而對制藥、醫療、疾病防治、生物化工等諸多方面產生巨大 的推動作用.日前用于解析生物大分子空間結構的主要手段是X射線晶體學技術和核滋共振波譜學.X射線晶體學可給出分子的高分辨結鉤,核磁共振波譜學那么可測定分子在溶液中的精確構 像,并可研究構像的動態變化.雖然 X射線晶體學和核磁共振波譜學是解析生物大分子結 構的強有力工具,但各有局限性.X射線晶體學解析的結構常常是分子的基態結鉤,而對解析分子的激發態和過渡態卻往往無能為力：生物大分子在體內常常發生相互作用并形成復合物而發揮功能,這些復合物的結晶化非常困難.核磁共振波譜學雖可獲

3、得分子在溶液中的結 構并可研究結構的動態變化,但目前只能用于分子量較小的生物大分子<10000道爾頓,而對分子量大的生物大分子尤其是超分子復合物卻無能為力.人類對生物體系的研究經歷了由個體到器官,由器官到組織,由組織到細胞,由細胞到生物大分子這樣一個層次由高到低的過程.隨著科學的開展,人們對生物體系的研究又轉向由低層次到高層次,由簡單體系到復雜體系.在此過程中,細胞作為生命的根本單位起著承 上啟下的重要作用.多少年來,科學家的一個夢想是能觀察到生物大分子在細胞內的行為, 幾十年來,人們對大量的生物大分子及其復合物應用電子顯微鏡進行研究,開展出了強有力的電子顯微學來研究生物大分子結構的方法

4、學.近年來,由于快速冷凍和低溫冷卻技術的引進,導致了冷凍電子顯微學技術的誕生.冷凍電鏡在研究生物大分子結構尤其是超分子體系的結構方面取得了突飛猛進的開展,在生物學領域的應用越來越受到重視,逐漸成為一種被普遍接受的公認的研究生物大分子尤其是超分子體系結構的有效研究手段,成為連接生物大分子和細胞的紐帶和橋梁.2冷凍電鏡開展過程及分類2.1 冷凍電鏡開展過程冷凍電子顯微鏡技術(cryo-electron microscopy )是在20世紀70年代提出的,早在 20 世紀70年代科學家們就利用冷凍電鏡研究病毒分子的結構,首次提出了冷凍電鏡技術的原 理、方法以及流程的概念.到了 20世紀90年代,隨著

5、冷凍傳輸裝置、場發射電子槍以及 CDD成像裝置的出現,冷凍電鏡單顆粒技術出現.21世紀初,冷凍電鏡技術進一步開展,利用三維重構技術獲得了二十面體病毒的三維結構,但此時冷凍電鏡的分辨率水平依然沒有得到突破,這限制了冷凍電鏡在生物大分子領域的應用,雖然冷凍電鏡和X射線晶體學、核磁共振被稱作結構生物學研究的三大利器,但不得不成認冷凍電鏡是三者當中最弱的一種技術手段,在現在已解析的一千多種膜蛋白結構當中,90%以上都采用的是 X射線晶體學方法,核磁共振在小分子量的蛋白結構解析中也發揮了重要的作用,而冷凍電鏡在蛋白結構解析當中所起的作用微乎其微.然而2021年12月5日,美國加州大學舊金山分校副教授程亦

6、凡與同事David Julius兩個實驗室合作,采用單電子計數探測器,以近原子分辨率(3.4埃),確定了在疼痛和熱知覺中起中央作用的一種膜蛋白TRPV1的結構,這一振奮人心的成果讓研究人員們開始重新審視冷凍電鏡在結構生物學研究中的所能發揮的作用.畢竟和X射線晶體學方法相比,它所需的樣品量很少,也無需生成晶體,這對于一些難結晶的蛋白質的研究帶來了新的希望.蛋白質TRPV1結構確實定標志著冷凍電鏡正式跨入“原子分辨率時代.2.2 冷凍電鏡分類目前我們討論的冷凍電鏡根本上指的都是冷凍透射電子顯微鏡,但是如果我們以使用冷凍技術的角度定義冷凍電鏡的話,冷凍電鏡主要可以分為冷凍透射電子顯微鏡、冷凍掃描電子

7、顯微鏡、冷凍蝕刻電子顯微鏡.2.2.1 冷凍透射電子顯微鏡冷凍透射電鏡(Cryo-TEM )通常是在普通透射電鏡上加裝樣品冷凍設備,將樣品冷卻 到液氮溫度(77K),用于觀測蛋白、生物切片等對溫度敏感的樣品.通過對樣品的冷凍, 可以降低電子束對樣品的損傷,減小樣品的形變,從而得到更加真實的樣品形貌.一臺冷凍透射電鏡的價格在600萬美元左右,價格極其昂貴,它的優點主要表達在以下幾個方面：第一是加速電壓高,電子能穿透厚樣品；第二是透鏡多,光學性能好；第三是 樣品臺穩定；第四是全自動,自動換液氮,自動換樣品,自動維持清潔.圖2.1冷凍透射電鏡及冷凍電鏡下高分辨病毒的三維重構圖2.2.2 冷凍掃描電子

8、顯微鏡掃描電鏡工作者都面臨著一個不能回避的事實, 就是所有生命科學以及許多材料科學的 樣品都含有液體成分.很多動植物組織的含水量到達 98% ,這是掃描電鏡工作者最難對付 的樣品問題.冷凍掃描電鏡(Cryo-SEM )技術是克服樣品含水問題的一個快速、可靠和有效的方法.這種技術還被廣泛地用于觀察一些“困難樣品,如那些對電子束敏感的具有不穩定性的樣品.各種高壓模式如 VP、LV和ESEM的出現,已允許掃描電鏡觀察未經冷凍和枯燥的樣 品.但是,冷凍掃描電鏡仍然是預防樣品喪失水分的最有效方法,它能應用于任何真空狀態,包括裝于SEM的Peltier臺以及向樣品室內沖以水汽的裝置.冷凍掃描電鏡還有一些其

9、他優 點,如具有冷凍斷裂的水平以及可以通過限制樣品升華刻蝕來選擇性地去除外表水分(冰) 等.冷凍電鏡根本的觀測流程如下列圖2.2所示：一高壓冷凍 .冷凍斷裂/噴涂 O 真空冷凍傳輸O OY.SEM 一Lefca EIM 100EMSCD 洶 止心 EM VCT100Hh Pressure FHigh Vac Epimer Codfer Vacuum Cryo Transfer圖2.2低溫掃描電鏡樣品制備及觀測流程2.2.3 冷凍蝕刻電子顯微鏡冷凍蝕刻(Freeze-etching)電鏡技術是從 50年代開始開展起來的一種將斷裂和復型相結合的制備透射電鏡樣品技術,亦稱冷凍斷裂(Freeze-fr

10、acture)或冷凍復型(Freeze-replica),用于細胞生物學等領域的顯微結構研究.冷凍蝕刻電鏡的優點：樣品通過冷凍,可使其微細結構接近于活體狀態；樣品經冷凍斷裂蝕刻后,能夠觀察到不同劈裂面的微細結構,進而可研究細胞內的膜性結構及內含物結構；冷凍蝕刻的樣品,經鉗、碳噴鍍而制備的復型膜,具有很強的立體感且能耐受電子 束轟擊和長期保存.缺點：冷凍也可造成樣品的人為損傷；斷裂面多產生在樣品結構最脆弱的部位,無法有目的地選擇.目前,冷凍蝕刻裝置的型號很多,但主要分為兩種類型：一種是專用冷凍蝕刻裝置,如EIKO公司生產的 FD-2A型、FD-3型,BALZERS 公司生產的 BAF300型；另

11、一種是真空噴鍍儀的冷凍蝕刻附件,如日立公司生產的HFZ-1型,它與FE-1型加溫蝕刻裝置一起安裝在HUS-5型真空噴鍍儀中使用.以上兩種類型各有優缺點,專用裝置優點在于操作方便,能 連續制樣,效率高.缺點是價格貴；附件裝置價格雖廉價,但不能連續操作,效率低.利用 冷凍蝕刻電鏡技術觀察到的紅細胞如圖 2.3所示.圖2.3紅細胞冷凍電鏡蝕刻圖3冷凍電鏡原理冷凍電子顯微學解析生物大分子及細胞結構的核心是透射電子顯微鏡成像, 其根本過程 包括樣品制備、透射電子顯微鏡成像、圖像處理及結構解析等幾個根本步驟 (圖3.1).在透 射電子顯微鏡成像中,電子槍產生的電子在高壓電場中被加速至亞光速并在高真空的顯微

12、鏡透射電子顯微鏡中的一系列電磁內部運動,根據高速運動的電子在磁場中發生偏轉的原理, 透鏡對電子進行會聚,并對穿透樣品過程中與樣品發生相互作用的電子進行聚焦成像以及放利用計算機對這些放大的圖大,最后在記錄介質上形成樣品放大幾千倍至幾十萬倍的圖像,像進行處理分析即可獲得樣品的精細結構.圖3.1冷凍電子顯微學解析結構根本步驟7 lerri-Gii Swn're-圖3.2冷凍電子顯微學原理示意圖透射電子顯微鏡成像過程中,電子束穿透樣品,將樣品的三維電勢密度分布函數沿著電子束的傳播方向投影至與傳播方向垂直的二維平面上.1968年,Aron Klug發現中央截面定理圖3.3,提出可以通過三維物體不

13、同角度的二維投影在計算機內進行三維重構來解析 獲得物體的三維結構.根據這一原理,利用透射電子顯微鏡獲得生物樣品多個角度的放大電 子顯微圖像,即有可能在計算機里重構出它的三維空間結構.賣空間情里葉空間圖3.3中央截面定理在冷凍電子顯微學結構解析的具體實踐中,依據不同生物樣品的性質及特點,可以采取不同的顯微鏡成像及三維重構方法.目前主要使用的幾種冷凍電子顯微學結構解析方法包括：電子晶體學、單顆粒重構技術、電子斷層掃描重構技術等,它們分別針對不同的生物大分子復合體及亞細胞結構進行解析.3.1 電子晶體學利用電子顯微鏡對生物大分子在一維、二維以致三維空間形成的高度有序重復排列的結構晶體成像或者收集衍射

14、圖樣,進而解析這些生物大分子的結構,這種方法稱為電子晶體學.其適合的樣品分子量范圍為10500kD,最高分辨率約1.9?.該方法與X射線晶體學的類似之處在于均需獲得高度均一的生物大分子的周期性排列,不同之處是利用電子顯微鏡除了可以獲得晶體的電子衍射外還可以通過獲得晶體的圖像來進行結構解析.3.2 單顆粒技術對分散分布的生物大分子分別成像,基于分子結構同一性的假設,對多個圖像進行統計分析,并通過對正、加和平均等圖像操作手段提升信噪比,進一步確認二維圖像之間的空間投影關系后經過三維重構獲得生物大分子的三維結構方法圖3.4.其適合的樣品分子量范圍為8050MD ,最高分到率約3?.利用單顆粒技術獲得三維重構的方法主要包括等價線方 法、隨機圓