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文檔簡介

1、問題：融解曲線前端不太正常。1：融解曲線形成原理融解曲線是不斷升溫至95 過程中采集的熒光值。也就是說在不同溫度條件下， DNA 進行解鏈，從雙鏈中游離出來，從而出現熒光值的降低。但是當溫度達到 DNA 解鏈一半的溫度時，也就是Tm 值時，會大量游離出來，從而使熒光值迅速降低，最后轉換成導數后形成高峰。利用熒光染料可以指示雙鏈DNA 熔點的性質， 通過熔點曲線分析可以識別擴增產物和引物二聚體，因而區分非特異性擴增。圖一：縱坐標為將熒光強度的變化對溫度的變化求導。（-dI/dT)（融解曲線呈單一峰時，表示無非特異性產物，熒光定量準確）2：融解曲線的兩種不同形式圖二對圖二曲線每一個位置求導，負導數

2、（-dI/dT ）作為縱坐標，得到圖三：圖三3：紅色框位置曲線解釋圖四融解曲線的采集過程中，溫度的變化為每上升，buffer成分（ Tris-HCl ）隨著溫度的上升， pH 降低，導致SYBR Green的熒光信號強度降低。因此在68 -75 度之間，雖然沒有DNA 雙鏈解開，但是熒光信號發生降低。溫度在 65 -68 之間（紅色框框位置），雖然溫度逐漸上升，但是熒光信號強度不變，可能的原因是：（ 1）雖然溫度上升， pH 值降低，但是如果 pH 值依舊在 SYBR Green 完全發光的范圍內，則熒光信號不發生變化。（ 2）起始熒光信號過強，熒光信號在一定范圍內的減弱不能被儀器檢測到，因此顯示的熒光信號不發生變化。4：AceQ 融解曲線問題 - 為什么有時候在融解曲線的前端出現凹下去的曲線。以 stepone one為例：圖五AceQ 促解鏈成分相對較多，抑制退火延伸；因此在退火延伸階段（60 度，1min ）存在部分鏈退火不充分；因此在信號剛開始采集階段，部分鏈會繼續退火形成雙鏈， 熒光信號增強， 退火充分后熒光信號達到最大值，此后隨著溫度的上升，pH 降低，導致

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