1、yiT論女第表站家Ran GTPase 在嗜熱四膜蟲(chóng)大核無(wú)絲分裂和程序性核死亡過(guò)程的功能 研究【摘要】：Ran(Ras-likenuclearprotein 是真核細(xì)胞核內(nèi)含量豐富的小分子 GTP 酶蛋白。Ran 蛋白作為重要的細(xì)胞增殖調(diào)控因子，能夠與不同 的調(diào)控因子和效應(yīng)分子相互作用，表現(xiàn)出細(xì)胞功能的多樣性，包括：調(diào) 節(jié)核物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)、核膜裝配、紡錘體組裝、DNA 復(fù)制、RNA 轉(zhuǎn)錄、mRNA 加工和運(yùn)輸及細(xì)胞周期調(diào)控等。不同生物中的Ran 同源物在有絲分裂、減數(shù)分裂及細(xì)胞凋亡過(guò)程中的功能存在差異，因此對(duì)不同物種中Ran 蛋白的深入研究有助于進(jìn)一步闡明該類(lèi)蛋白新的生物學(xué)功能。嗜熱四膜蟲(chóng)(Tetr

2、ahymenathermophila 是一種單細(xì)胞真核生物，屬于纖毛 類(lèi)原生動(dòng)物，在單個(gè)細(xì)胞內(nèi)集中了維持生命和延續(xù)后代所必需的一切 功能，具有精細(xì)的細(xì)胞周期進(jìn)程和復(fù)雜的核發(fā)育過(guò)程，是研究蛋白功能理想的模式體系。四膜蟲(chóng)生命過(guò)程中可經(jīng)歷無(wú)性生殖和有性生殖兩種 生殖周期。在無(wú)性生殖期，大核進(jìn)行無(wú)絲分裂，盡管沒(méi)有紡錘體形成，但 核內(nèi)微管重新組裝排列成特定形式以幫助大核分裂。在有性生殖階段隨著新小核和新大核發(fā)育形成,親本大核通過(guò)程序性核死亡(programmednucleardeath,PND 的途徑退化。 四膜蟲(chóng)中這種獨(dú)特的核分 裂方式及核發(fā)育過(guò)程的分子調(diào)控機(jī)制目前并不清楚。本實(shí)驗(yàn)對(duì)Ran蛋白在嗜熱四

3、膜蟲(chóng)大核無(wú)絲分裂和親本大核程序性死亡過(guò)程中的調(diào) 控功能進(jìn)行研究，獲得如下結(jié)果：1.四膜蟲(chóng) RAN1 基因的生物信息學(xué)分 析 RAN1是嗜熱四膜蟲(chóng)中 Ran 蛋白編碼基因，全長(zhǎng) 1443bp 編碼 225 個(gè)氨基酸，擬編碼蛋白質(zhì) Rani 預(yù)測(cè)分子量為 25.6kD。Rani 氨基酸序列 與已報(bào)道的動(dòng)、 植物 Ran 蛋白序列有較高的一致性； 系統(tǒng)進(jìn)化分析結(jié) 果表明，四膜蟲(chóng) Rani 與草履蟲(chóng)中 Ran 的進(jìn)化關(guān)系最近。四膜蟲(chóng) Rani 蛋白包含小GTPase 蛋白共有的 GDP/GTP 結(jié)合區(qū)和開(kāi)關(guān)結(jié)構(gòu)域，以及 Ran 蛋白亞家族特有的輔助調(diào)控蛋白結(jié)合位點(diǎn)和酸性 C-末端序列。RAN1 基因在

4、四膜蟲(chóng)整個(gè)生命周期中都有較高的表達(dá)水平。分析 Rani各輔助調(diào)控蛋白的功能結(jié)構(gòu)域時(shí)發(fā)現(xiàn)，它們與其它物種該蛋白同源物 的序列存在差異，暗示 Rani 在四膜蟲(chóng)中可能存在與其同源蛋白類(lèi)似但 有差別的功能。2.Ran1 調(diào)控四膜蟲(chóng)無(wú)性生殖中大核無(wú)絲分裂過(guò)程帶有HA 標(biāo)簽的野生型 Rani 以及模擬 GDP、 GTP 鎖定形式的 Rani 突變 體,Ran仃25N和RaniQ70L在四膜蟲(chóng)無(wú)性生殖細(xì)胞周期表現(xiàn)出不同的 大核定位模式，且 Rani 蛋白上各調(diào)控因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域在不同形式 Rani 的特異性大核定位中發(fā)揮各自不同的功能。通過(guò)同源重組敲除 RANi基因，并篩選獲得 RANi 基因部分敲除細(xì)胞株

5、 i RANi.i RANI 細(xì)胞 表現(xiàn)出繁殖速度下降及大核無(wú)絲分裂異常。通過(guò)免疫熒光分析發(fā)現(xiàn)，部分敲除 RANi 基因?qū)е聼o(wú)絲分裂各時(shí)期大核內(nèi)微管排列形式紊亂，從而使得復(fù)制的大核染色體不能分開(kāi)，最終導(dǎo)致大核增殖受阻。過(guò)表 達(dá)RaniWT/T25N/Q70L 擾亂 Rani 循環(huán)，進(jìn)而影響大核無(wú)絲分裂進(jìn)程并 導(dǎo)致繁殖速度下降，且 RANi 及其突變基因的過(guò)表達(dá)量與異常無(wú)絲分 裂核型態(tài)細(xì)胞比例呈正相關(guān)。 過(guò)表達(dá) Ran 仃 25N 相比過(guò)表達(dá) RaniWT 和 Q70L 對(duì)無(wú)絲分裂和大核內(nèi)微管組裝的抑制效應(yīng)更加明顯。過(guò)表達(dá)Rani 及其突變體蛋白破壞了正常的 Rani 分布形式。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，

6、wyiT論女第表百家四膜蟲(chóng)中 RanGTPase可能通過(guò) Ran 1GDP/GTP 循環(huán)的形式，參與調(diào)控 大核內(nèi)微管網(wǎng)絡(luò)的精確重排，從而調(diào)控大核無(wú)絲分裂進(jìn)程。3.Ranl 調(diào)控 四膜蟲(chóng)有性生殖中親本大核程序性核死亡過(guò)程本研究首先分析敲除 RAN1 基因?qū)λ哪はx(chóng)接合生殖過(guò)程核發(fā)育和某些細(xì)胞核PND 進(jìn)程的影響,發(fā)現(xiàn)接合早期時(shí)核發(fā)育正常，接合中晚期 3 個(gè)小核減數(shù)分裂產(chǎn)物 和親本大核的 PND 進(jìn)程受到抑制。而當(dāng) RAN1 部分敲除細(xì)胞與 RAN1 過(guò)表達(dá)細(xì)胞接合配對(duì)時(shí),PND 抑制得到一定程度的恢復(fù)。免疫熒光分 析HA-RanlWT/T25N/Q70L 在四膜蟲(chóng)有性生殖過(guò)程中的動(dòng)態(tài)定位模 式，尤

7、其是在親本大核 PND 過(guò)程中的定位，表明 Ran 1GDP/GTP 循環(huán)可 能發(fā)生在 PND 的親本大核的核質(zhì)屏障兩側(cè)。同時(shí)分析 Rani 蛋白是否 參與調(diào)控凋亡促進(jìn) 因子(Apoptosis-inducingfactor,AIF)在親本大核 PND 過(guò)程由線(xiàn)粒體向親本大核轉(zhuǎn)移。部分敲除RAN1 基因抑制 AIF向 PND 的親本大核轉(zhuǎn)移，并且 Ran 1GDP 和 Ran1GTP 分別促進(jìn)和抑制AIF 的核輸入，表明 Ran 1GDP/GTP 循環(huán)可能參與調(diào)控 AIF 向 PND 的 親本大核運(yùn)輸。最后構(gòu)建了將 AIF 靶向到親本大核的人工系統(tǒng)，即不 依賴(lài)于 Rani 而由 improti

8、na 介導(dǎo)的 AIF 核輸入系統(tǒng)。利用該系統(tǒng)將 AIF 主動(dòng)輸入到 i RAN1 細(xì)胞的親本大核中，發(fā)現(xiàn) iARANI 配對(duì)細(xì)胞 的親本大核PND 進(jìn)程得到一定程度的恢復(fù)，但 3 個(gè)小核減數(shù)分裂產(chǎn)物 的 PND 異常沒(méi)有恢復(fù)，表明 AIF 是親本大核 PND 進(jìn)程中重要的效應(yīng) 因子。這些結(jié)果表明,Rani 可能通過(guò)調(diào)節(jié) AIF 向親本大核的輸入來(lái)調(diào) 控親本大核的程序性死亡過(guò)程。本研究首次對(duì)Rani 蛋白在原生動(dòng)物細(xì)胞中的定位和功能進(jìn)行了系統(tǒng)研究，表明 Rani 調(diào)控嗜熱四膜蟲(chóng)無(wú)性yiT論女第表站家生殖期大核無(wú)絲分裂過(guò)程，并通過(guò) AIF 信號(hào)通路在有性生殖期親本大 核程序死亡過(guò)程中發(fā)揮重要作用，

9、說(shuō)明 RanGDP/GTP 循環(huán)是普遍存在 于真核細(xì)胞中的保守的調(diào)控機(jī)制。【關(guān)鍵詞】：RanGTPase 嗜熱四膜蟲(chóng) 無(wú)絲分裂程序性核死亡【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)【學(xué)位級(jí)別】：博士【學(xué)位授予年份】：2013【分類(lèi)號(hào)】：Q51【目錄】：中文摘要 15-18ABSTRACT18-21 第一章文獻(xiàn)綜述21-401.1RanGTPase 蛋白概述 21-231.2Ran 介導(dǎo)核質(zhì)運(yùn)輸 23-241.3Ran在細(xì)胞有絲分裂中的調(diào)控功能 24-27131 功能多樣性 251.3.2 紡錘體 組裝的 RanGTP 濃度梯度調(diào)控機(jī)制 25-261.3.3Ran 釋放紡錘體組裝因 子機(jī)制26-271.4Ran

10、 參與細(xì)胞凋亡 27-281.4.1Ran 調(diào)控凋亡細(xì)胞微管重 排271.4.2 凋亡早期 RanGTP 濃度梯度耗散 27-281.5 模式生物嗜熱四 膜蟲(chóng)進(jìn)行細(xì)胞生物學(xué)研究的優(yōu)勢(shì)28-311.5.1 四膜蟲(chóng)生物學(xué)特征28-301.5.2 四膜蟲(chóng)的研究條件 301.5.3 四膜蟲(chóng)內(nèi)成熟的基因重組技術(shù)30-311.6 四膜蟲(chóng)無(wú)性生殖細(xì)胞周期 31-331.6.1 四膜蟲(chóng)無(wú)性生殖細(xì)胞周 期進(jìn)程 31-321.6.2 四膜蟲(chóng)大核無(wú)絲分裂特點(diǎn) 321.6.3 大核無(wú)絲分裂微 管組裝32-331.7 四膜蟲(chóng)程序性核死亡研究進(jìn)展 33-361.7.1 四膜蟲(chóng)程序性核死亡概述 34-351.7.2 線(xiàn)粒體

11、在程序性核死亡中的功能35-361.7.3AIF 途徑參與核程序性死亡過(guò)程 361.8 本研究立題依據(jù)與總 體設(shè)計(jì) 36-401.8.1 研究背景和意義 36-381.8.2 研究?jī)?nèi)容與技術(shù)路線(xiàn)38-40 第二章嗜熱四膜蟲(chóng) RAN1 基因的鑒定及序列分析 40-512.1 引言402.2 材料 40-41221 細(xì)胞株、菌株及質(zhì)粒 40-41222 試劑及工具酶412.2.3 儀器設(shè)備 412.3 方法 41-422.3.1RAN1 基因生物信息學(xué)分析412.3.2 四膜蟲(chóng)的培養(yǎng) 412.3.3PCR 擴(kuò)增和測(cè)序 412.3.4 四膜蟲(chóng) RNA 的 提取及 cDNA 的合成 41-422.3.

12、5 實(shí)時(shí)熒光定量 PCR 分析 RAN1 基因 表達(dá)422.3.6Ran1 輔助調(diào)控蛋白保守結(jié)構(gòu)域分析 422.4 結(jié)果 42-492.4.1四膜蟲(chóng)中 RAN1基因及其蛋白質(zhì)序列 42-442.4.2四膜蟲(chóng) Ran1保守功 能結(jié)構(gòu)域分析 44-462.4.3 四膜蟲(chóng) Ran1 蛋白與其它物種 Ran 蛋白的同源性分析 46-472.4.4RAN1 基因表達(dá)譜分析 47-482.4.5 四膜蟲(chóng)各 Ran1輔助調(diào)控蛋白功能結(jié)構(gòu)域分析 48-492.5 討論 49-502.6 小結(jié) 50-51 第三章嗜熱四膜蟲(chóng) Ran1 參與調(diào)控?zé)o性生殖過(guò)程大核無(wú)絲分裂51-863.1 引言 513.2 材料 51

13、-553.2.1 細(xì)胞株、菌株及質(zhì)粒 51-523.2.2 試劑及工具酶 52-543.2.3 儀器設(shè)備 54-553.3 方法 55-613.3.1 四膜蟲(chóng)細(xì)胞的培養(yǎng)和 同步化誘導(dǎo) 553.3.2 四膜蟲(chóng)大核基因組 DNA 的提取 553.3.3RAN1 基 因定點(diǎn)突變 55-563.3.4 內(nèi)源性表達(dá) HA-Ran1WT/T25N/Q70L 融合蛋白 四膜蟲(chóng)細(xì)胞株的構(gòu)建 56-573.3.5 過(guò)表達(dá) HA-Ran1 結(jié)構(gòu)域及突變體四膜蟲(chóng)細(xì)胞株的構(gòu)建 57-583.3.6RAN1 基因敲除四膜蟲(chóng)細(xì)胞株的構(gòu)建58-593.3.7Westernblot 檢測(cè) HA-Ran1 及其突變蛋白的表達(dá)

14、593.3.8 間接免疫熒光法分析 HA-Ran1 及其突變體蛋白的定位 59-603.3.9 間接免疫熒光法分析無(wú)絲分裂大核內(nèi)微管組裝603310 核質(zhì)熒光信號(hào)比計(jì)算 603.3.11 標(biāo)準(zhǔn)曲線(xiàn)法實(shí)時(shí)熒光定量 PCR60-613.4 結(jié)果 1： Rani 及其模擬 GDP和 GTP鎖定形式的突變體在嗜熱四膜蟲(chóng)大核無(wú)絲分裂 過(guò)程的定位 61-683.4.1HA-Ran1WT/T25N/Q70L 細(xì)胞株的構(gòu)建及鑒定61-643.4.2HA-Ran1WT/T25N/Q70L 在四膜蟲(chóng)大核無(wú)絲分裂過(guò)程的定 位64-663.4.3Ran1 蛋白單獨(dú)輔助因子結(jié)合結(jié)構(gòu)域及缺失突變細(xì)胞株 的構(gòu)建及鑒定 66

15、-673.4.4 過(guò)表達(dá)的 HA-GAP/BP1/GEF/C-del 在四膜蟲(chóng) 大核無(wú)絲分裂過(guò)程的定位 67-683.5 結(jié)果 2：部分敲除 RAN1 基因?qū)λ?膜蟲(chóng)大核無(wú)絲分裂的影響 68-743.5.1RAN1 部分敲除細(xì)胞株 i RAN1 的構(gòu)建及鑒定68-703.52 RAN 纟田胞株大核無(wú)絲分裂表型分析 70-723.5.3i RAN細(xì)胞株無(wú)絲分裂大核核內(nèi)微管組裝72-743.6 結(jié)果3:過(guò)表達(dá) Ran1 及其模擬 GTP、GDP 鎖定形式的突變體對(duì)四膜蟲(chóng)大 核無(wú)絲分裂的影響 74-813.6.1 過(guò)表達(dá) Ran 1WT/T25N/Q70L 細(xì)胞株OERan1WT/T25N/Q70L

16、 的構(gòu)建及鑒定 74-753.6.2 過(guò)表達(dá) Ran1WT/T25N/Q70L 對(duì)四 膜蟲(chóng)繁 殖速度 的影響75- 763.6.3OERan1WT/T25N/Q70L 細(xì)胞株大核無(wú)絲分裂表型分析76- 783.6.4 過(guò)表達(dá) Ran 1WT/T25N/Q70L 對(duì)無(wú)絲分裂大核內(nèi)微管組裝的影響 78-793.6.5 過(guò)表達(dá)的 HA-Ran1WT/T25N/Q70L 在四膜蟲(chóng)大核無(wú)絲 分裂過(guò)程的定位 79-813.7 討論 81-843.7.1Ran1 及其 GTP、GDP 鎖定 形式突變體的分布形式揭示Ran 1GDP/GTP循環(huán)的存在 81-823.7.2RAN1基因是四膜蟲(chóng)無(wú)絲分裂大核核內(nèi)微

17、管正常組裝所必 需的 82-833.7.3 破壞 Ran1GDP/GTP 循環(huán)平衡抑制大核無(wú)絲分裂核內(nèi)微管組裝 83-843.8 小結(jié) 84-86 第四章嗜熱四膜蟲(chóng) Rani 參與調(diào)控有性 生殖過(guò)程親本大核程序性核死亡86-1134.1 引言 86-874.2 材料87-89421 細(xì)胞株、菌株及質(zhì)粒 874.2.2 試劑及工具酶 87-894.2.3 儀器 設(shè)備 894.3 方法 89-934.3.1 四膜蟲(chóng)細(xì)胞的接合配對(duì) 894.3.2 內(nèi)源性表達(dá)HA-AIF 細(xì)胞株的構(gòu)建 89-904.3.3 內(nèi)源性表達(dá) HA-AIF 的 RAN1 不完 全敲除細(xì)胞株的構(gòu)建 904.3.4 內(nèi)源性表達(dá)

18、HA-AIF 的 RAN1 基因突變 細(xì)胞株的構(gòu)建 90-914.3.5 過(guò)表達(dá) HA-import ina全長(zhǎng)及截短突變體細(xì) 胞株的構(gòu)建91-924.3.6 過(guò)表達(dá) HA-lma1 -AIF 融合蛋白的 RAN1 部 分敲除細(xì)胞株的構(gòu)建 92-934.3.7吖啶橙和 Hoechst33342活體熒光染料 雙染法檢測(cè)凋亡細(xì)胞核 934.3.8 線(xiàn)粒體活體染色及觀察 934.3.9 間接免 疫熒光法分析 HA-融合蛋白的定位 934.4 結(jié)果 93-1114.4.1 部分敲除基 因?qū)λ哪はx(chóng)接合期核發(fā)育及親本大核 PND 進(jìn)程的影響 93-974.4.2HA-Ran1WT/T25N/Q70L 在四膜蟲(chóng)接合生殖過(guò)程的定位 97-1014.4.3iARAN1/HA-AIF 和 WT/HA-AIF細(xì)胞株的構(gòu)建和鑒定 101-1024.4.4部分敲除RAN1基因?qū)λ哪はx(chóng)親本大核PND 過(guò)程 AIF 核輸入的影響 102-1044.4.5Ran 仃 25N/H