1、http:/ 聚丙烯酰胺凝膠電泳聚丙烯酰胺凝膠電泳(polyacrylamide gel electrophoresis(polyacrylamide gel electrophoresis，簡稱簡稱PAGE)PAGE)是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。是以聚丙烯酰胺凝膠作為支持介質的一種常用電泳技術。 1 1、聚丙烯酰胺凝膠由、聚丙烯酰胺凝膠由單體丙烯酰胺單體丙烯酰胺和和甲基雙丙烯酰胺甲基雙丙烯酰胺聚合而形成聚合而形成的三維網狀結構，聚合過程由自由基催化完成。的三維網狀結構，聚合過程由自由基催化完成。 2 2、催化聚合的常用方法有兩種：化學聚合法和光聚合法。、催化聚合的常用方

2、法有兩種：化學聚合法和光聚合法。 (1)(1)在化學聚合過程中，以在化學聚合過程中，以過硫酸銨（過硫酸銨（APAP）為催化劑，以為催化劑，以四甲基乙四甲基乙二胺（二胺（TEMEDTEMED）為加速劑為加速劑, TEMED, TEMED催化催化APAP產生自由基；產生自由基； (2)(2)在光聚合過程中，以在光聚合過程中，以核黃素核黃素為催化劑，光催化核黃素產生自由為催化劑，光催化核黃素產生自由基。自由基引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲基雙丙烯酰胺與丙烯基。自由基引發丙烯酰胺單體聚合，同時甲基雙丙烯酰胺與丙烯酰胺鏈間產生甲基鍵交聯，從而形成三維網狀結構。酰胺鏈間產生甲基鍵交聯，從而形成三維網狀結構。

3、http:/ g(6)(6)凝膠孔徑可調節，根據被分離物的分子量選擇合適的濃度，凝膠孔徑可調節，根據被分離物的分子量選擇合適的濃度，通過改變單體及交聯劑的濃度調節凝膠的孔徑；通過改變單體及交聯劑的濃度調節凝膠的孔徑；(7)(7)分辨率高，尤其在不連續凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和分辨率高，尤其在不連續凝膠電泳中，集濃縮、分子篩和電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳電荷效應為一體。因而較醋酸纖維薄膜電泳、瓊脂糖電泳等有更高的分辨率。等有更高的分辨率。http:/ 1. 根據其有無濃縮效應，分為：根據其有無濃縮效應，分為：（1 1）連續系統）連續系統連續系統電泳體系中緩沖液連續系統電泳

4、體系中緩沖液pHpH值及凝膠濃度相同，帶值及凝膠濃度相同，帶電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應電顆粒在電場作用下，主要靠電荷和分子篩效應 （2 2）不連續系統）不連續系統不連續系統中由于緩沖液離子成分，不連續系統中由于緩沖液離子成分，pHpH，凝膠濃，凝膠濃度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，度及電位梯度的不連續性，帶電顆粒在電場中泳動不僅有電荷效應，分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較分子篩效應，還具有濃縮效應，因而其分離條帶清晰度及分辨率均較前者佳。前者佳。 2. 2. 根據蛋白質樣品變性與否，分為：根據蛋白質樣品變性與否，分為：（1

5、 1）變性電泳）變性電泳也就是也就是SDS-PAGESDS-PAGE，蛋白質失去二三級結構；，蛋白質失去二三級結構；（2 2）非變性電泳）非變性電泳 蛋白質能夠保持完整狀態，并依據蛋白質的分子蛋白質能夠保持完整狀態，并依據蛋白質的分子量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。量大小、蛋白質的形狀及其所附帶的電荷量而逐漸呈梯度分開。3.3.根據電泳槽體系的類型，分為：根據電泳槽體系的類型，分為： （1 1）圓盤電泳）圓盤電泳（2 2）板狀電泳）板狀電泳兩者電泳原理完全相同。兩者電泳原理完全相同。 http:/ SDS-PAGE SDS-PAGE僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開

6、蛋白質。該技術僅根據蛋白質亞基分子量的不同就可以分開蛋白質。該技術最初由最初由shapiroshapiro于于19671967年建立，他們發現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加年建立，他們發現在樣品介質和丙烯酰胺凝膠中加入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分入離子去污劑和強還原劑后，蛋白質亞基的電泳遷移率主要取決于亞基分子量的大?。梢院雎噪姾梢蛩兀湓碓谟冢鹤恿康拇笮。梢院雎噪姾梢蛩兀?，其原理在于：1.1.去電荷：去電荷：由于由于SDSSDS（十二烷基硫酸鈉）產生的十二烷基硫酸根帶負電，（十二烷基硫酸鈉）產生的十二烷基硫酸根帶負電，使各種蛋白質使各種蛋白質-SDS-

7、SDS復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋復合物都帶上相同密度的負電荷，它的量大大超過了蛋白質分子原的電荷量，白質分子原的電荷量， 因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別；因而掩蓋了不同種蛋白質間原有的電荷差別； 2.2.破壞結構：破壞結構：SDSSDS能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋能斷裂分子內和分子間的氫鍵，使分子去折疊，破壞蛋白分子的二、三級結構。如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中白分子的二、三級結構。如果蛋白質是由不同的亞基組成的，它在電泳中可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶；可能會形成分別對應于各個亞基的幾條帶；3.3.統一構象：統一構象：SDS

8、SDS與蛋白質結合后，還可引起構象改變，蛋白質與蛋白質結合后，還可引起構象改變，蛋白質-SDS-SDS復合復合物形成近似物形成近似“雪茄煙雪茄煙”形的長橢圓棒，不同蛋白質的形的長橢圓棒，不同蛋白質的SDSSDS復合物的短軸長復合物的短軸長度都一樣，約為度都一樣，約為18A18A； 這樣的蛋白質這樣的蛋白質-SDS-SDS復合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原來的復合物，在凝膠中的遷移率，不再受蛋白質原來的電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小電荷和形狀的影響，而取決于分子量的大小。SDS-PAGESDS-PAGE的原理的原理http:/ 4.1 不連續不連續PAGEPAGE的原理的原理htt

9、p:/ 不連續體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液所組成。不連續體系由濃縮膠、分離膠及電極緩沖液所組成。1. 1. 濃縮膠是由核黃素催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為濃縮膠是由核黃素催化聚合而成的大孔膠，凝膠緩沖液為pH6.7pH6.7的的Tris-HC1Tris-HC1。2. 2. 分離膠是由分離膠是由APAP催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為催化聚合而成的小孔膠，凝膠緩沖液為pH8.9 pH8.9 Tris-HC1Tris-HC1。3. 3. 電極緩沖液是電極緩沖液是pH8.3 Tris-pH8.3 Tris-甘氨酸緩沖液。甘氨酸緩沖液。 2 2種孔徑的凝膠、種孔徑的凝膠、2 2種緩沖體系、種

10、緩沖體系、3 3種種pHpH值使不連續體系形成值使不連續體系形成了凝膠孔徑、了凝膠孔徑、pHpH值、緩沖液離子成分的不連續性，這是樣品濃值、緩沖液離子成分的不連續性，這是樣品濃縮的主要因素?？s的主要因素。http:/ 前導離子或快離子：前導離子或快離子：HC1HC1解離出的氯根解離出的氯根(C1(C1- -) ) 尾隨離子尾隨離子(trailing ion)(trailing ion)或慢離子：甘氨酸根或慢離子：甘氨酸根 m mclcl clclmmp p p p m mG G G G(Cl(Cl代表氯根，代表氯根，P P代表蛋白質，代表蛋白質，G G代表甘氨代表甘氨酸根酸根) )有效遷移率有效遷移率= =m m ，m m為遷移率，為遷移率，