1、酚氯仿法提取DNA的原理 作者: 渭水凡夫 (站內聯系TA) 發布: 2013-04-06 最近在博客上看到的一篇 可以作為入門級 分子生物學十萬個為什么 和大家分享一下 用酚抽提細胞DNA時，有什么作用？ 使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA 聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 使用酚的優點：1. 有效變性蛋白質；2. 抑制了DNase的降解作用。 缺點：1. 能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺

2、點；加速有機相與液相分層。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中） 用酚氯仿抽提細胞基因組DNA時，通常要在酚-氯仿中加少許異戊醇，為什么？ 異戊醇：減少蛋白質變性操作過程中產生的氣泡。異戊醇可以降低表面張力，從而減少氣泡產生。另外，異戊醇有助于分相，使離心后的上層含DNA的水相、中間的變性蛋白相及下層有機溶劑相維持穩定。 用乙醇沉淀DNA時，為什么加入單價的陽離子？ 用乙醇沉淀DNA時，通常要在溶液中加入單價的陽離子，如NaCl 或 NaAc，Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，而易于聚集沉淀。 原理：動物和植物組織的脫氧核糖核蛋白（DNP

3、）可溶于水或濃鹽溶液（如1mol/L氯化鈉），但在氯化鈉鹽溶液中溶解度最低，而核酸核蛋白（RNP）則在氯化鈉中溶解度最大，利用這一性質可將其分開。 將沉淀物溶解于生理鹽水，加入去污劑十二烷基硫酸鈉（SDS）溶液，使DNA與蛋白質分離開。加入固體氯化鈉使其濃度達到1mol/L，使DNA溶解。加氯仿-異戊醇去除蛋白質，也可重復該步操作得較純DNA。最后用95%乙醇沉淀DNA。 溶解：將離心后除去RNA的沉淀，用30ml生理鹽水溶解，充分攪拌后，勻漿一次。加4毫升10SDS溶液，使溶液的SDS濃度達到1左右，邊加邊攪拌，放置60 水浴保溫 10分鐘（不停攪拌），冷卻。加固體氯化鈉，使溶液氯化鈉濃度達

4、到1mol/L，充分攪拌10分鐘； 除雜質：加等體積氯仿-異戊醇混合液，充分震蕩10分鐘， 8000 r/min離心7分鐘，取上層液量好體積，倒入燒杯中（離心管），加同體積的氯仿-異戊醇混合液，重復上次操作。直至界面不出現蛋白凝膠為止； 沉淀：準確量取上清液體積，加2倍體積95冷乙醇，攪拌后，置冰箱靜止冷卻，待有白色絲狀物出現，約10-15分鐘，離心8000 r/min離心7分鐘，得白色沉淀； 溶解：將沉淀物用約10毫升溶解,得DNA溶液。 溶液I溶菌液： 溶菌酶：它是糖苷水解酶，能水解菌體細胞壁的主要化學成分肽聚糖中的-1,4糖苷鍵，因而具有溶菌的作用。當溶液中pH小于8時，溶菌酶作用受到抑

5、制。 葡萄糖：增加溶液的粘度，維持滲透壓，防止DNA受機械剪切力作用而降解。 EDTA：（1）螯合Mg2、Ca2等金屬離子，抑制脫氧核糖核酸酶對DNA的降解作用（DNase作用時需要一定的金屬離子作輔基）;（2）EDTA的存在，有利于溶菌酶的作用，因為溶菌酶的反應要求有較低的離子強度的環境。 溶液IINaOHSDS液：NaOH：核酸在pH大于5，小于9的溶液中，是穩定的。但當pH12或pH3時，就會引起雙鏈之間氫鍵的解離而變性。在溶液II中的NaOH濃度為L，加抽提液時，該系統的pH就高達，因而促使染色體DNA與質粒DNA的變性。 SDS：SDS是離子型表面活性劑。它主要功能有：（1）溶解細胞

6、膜上的脂質與蛋白，因而溶解膜蛋白而破壞細胞膜。（2）解聚細胞中的核蛋白。（3）SDS能與蛋白質結合成為R-O-SO3-R-蛋白質的復合物，使蛋白質變性而沉淀下來。但是SDS能抑制核糖核酸酶的作用，所以在以后的提取過程中，必須把它去除干凈，防止在下一步操作中（用RNase去除RNA時）受到干擾。 溶液III-3molL NaAc（）溶液：NaAc的水溶液呈堿性，為了調節pH至，必須加入大量的冰醋酸。所以該溶液實際上是NaAc-HAc的緩沖液。用的NaAc溶液是為了把的抽提液，調回pH至中性，使變性的質粒DNA能夠復性，并能穩定存在。而高鹽的3molL NaAc有利于變性的大分子染色體DNA、RN

7、A以及SDS-蛋白復合物凝聚而沉淀之。前者是因為中和核酸上的電荷，減少相斥力而互相聚合，后者是因為鈉鹽與SDS蛋白復合物作用后，能形成較小的鈉鹽形式復合物，使沉淀更完全。 為什么用無水乙醇沉淀DNA？ 用無水乙醇沉淀DNA，這是實驗中最常用的沉淀DNA的方 法。乙醇的優點是可以任意比和水相混溶，乙醇與核酸不會起任何化學反應，對DNA很安全，因此是理想的沉淀劑。 DNA溶液是DNA以水合狀態穩定存在，當加入乙醇時，乙醇會奪去DNA周圍的水分子，使DNA失水而易于聚合。一般實驗中，是加2倍體積的無水乙醇與DNA相混合，其乙醇的最終含量占67左右。因而也可改用95乙醇來替代無水乙醇（因為無水乙醇的價

8、格遠遠比95乙醇昂貴）。但是加95的乙醇使總體積增大，而DNA在溶液中有一定程度的溶解，因而DNA損失也增大，尤其用多次乙醇沉淀時，就會影響收得率。折中的做法是初次沉淀DNA時可用95乙醇代替無水乙酵，最后的沉淀步驟要使用無水乙醇。也可以用倍體積的異丙醇選擇性沉淀DNA。一般在室溫下放置1530分鐘即可。 在用乙醇沉淀DNA時，為什么一定要加NaAc或NaCl至最終濃度達？ 在pH為8左右的溶液中，DNA分子是帶負電荷的，加一定濃度的NaAc或NaCl，使Na+中和DNA分子上的負電荷，減少DNA分子之間的同性電荷相斥力，易于互相聚合而形成DNA鈉鹽沉淀，當加入的鹽溶液濃度太低時，只有部分DN

9、A形成DNA鈉鹽而聚合，這樣就造成DNA沉淀不完全，當加入的鹽溶液濃度太高時，其效果也不好。在沉淀的DNA中，由于過多的鹽雜質存在，影響DNA的酶切等反應，必須要進行洗滌或重沉淀。 加核糖核酸酶降解核糖核酸后，為什么再要用SDS與KAc來處理？ 加進去的RNase本身是一種蛋白質，為了純化DNA，又必須去除之，加SDS可使它們成為SDS-蛋白復合物沉淀，再加KAc使這些復合物轉變為溶解度更小的鉀鹽形式的SDS-蛋白質復合物，使沉淀更加完全。也可用飽和酚、氯仿抽提再沉淀，去除RNase。在溶液中，有人以KAc代替NaAc，也可以收到較好效果。 7為什么在保存或抽提DNA過程中，一般采用TE緩沖液

10、？ 在基因操作實驗中，選擇緩沖液的主要原則是考慮DNA的穩定性及緩沖液成分不產生干擾作用。磷酸鹽緩沖系統（pKa）和硼酸系統（）等雖然也都符合細胞內環境的生理范圍(pH)，可作DNA的保存液，但在轉化實驗時，磷酸根離子的種類及數量將與Ca2產生Ca3(PO4)2沉淀；在DNA反應時，不同的酶對輔助因子的種類及數量要求不同，有的要求高離子濃度，有的則要求低鹽濃度，采用Tris-HCl（）的緩沖系統，由于緩沖液是TrisH+/Tris，不存在金屬離子的干擾作用，故在提取或保存DNA時，大都采用Tris-HCl系統，而TE緩沖液中的EDTA更能穩 苯酚、氯仿、異戊醇在DNA提取時的作用 抽提DNA去

11、除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？ 酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約1015的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經酚第一次抽

12、提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。 為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？ 在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。 苯

13、酚：氯仿：異戊醇為什么要25:24:1？ 抽提DNA去除蛋白質時，怎樣使用酚與氯仿較好？酚與氯仿是非極性分子，水是極性分子，當蛋白水溶液與酚或氯仿混合時，蛋白質分子之間的水分子就被酚或氯仿擠去，使蛋白失去水合狀態而變性。經過離心，變性蛋白質的密度比水的密度為大，因而與水相分離，沉淀在水相下面，從而與溶解在水相中的DNA分開。而酚與氯仿有機溶劑比重更大，保留在最下層。作為表面變性的酚與氯仿，在去除蛋白質的作用中，各有利弊，酚的變性作用大，但酚與水相有一定程度的互溶，大約1015的水溶解在酚相中，因而損失了這部分水相中的DNA，而氯仿的變性作用不如酚效果好，但氯仿與水不相混溶，不會帶走DNA。所以

14、在抽提過程中，混合使用酚與氯仿效果最好。經酚第一次抽提后的水相中有殘留的酚，由于酚與氯仿是互溶的，可用氯仿第二次變性蛋白質，此時一起將酚帶走。也可以在第二次抽提時，將酚與氯仿混合（1:1）使用。 為什么用酚與氯仿抽提DNA時，還要加少量的異戊酵？在抽提DNA時，為了混合均勻，必須劇烈振蕩容器數次，這時在混合液內易產生氣泡，氣泡會阻止相互間的充分作用。加入異 戊醇能降低分子表面張力，所以能減少抽提過程中的泡沫產生。一般采用氯仿與異戊酵為24：1之比。也可采用酚、氯仿與異戊醇之比為25：24:1（不必先配制，可在臨用前把一份酚加一份24：1的氯仿與異戊醇即成），同時異戊醇有助于分相，使離心后的上層水相，中層變性蛋白相以及下層有機溶劑相維持穩定。 用酚抽提細胞DNA時，有什么作用？ 使蛋白質變性，同時抑制了DNase的降解作用。用苯酚處理勻漿液時，由于蛋白與DNA 聯結鍵已斷，蛋白分子表面又含有很多極性基團與苯酚相似相溶。蛋白分子溶于酚相，而DNA溶于水相。 使用酚的優點：1. 有效變性蛋白質；2. 抑制了DNase的降解作用。 缺點：1. 能溶解10-15%的水，從而溶解一部分poly（A）RNA。2. 不能完全抑制RNase的活性。 氯仿的作用？ 氯仿：克服酚的缺點；加速有機相與液相分層。 最后用氯仿抽提：去除核酸溶液中的跡量酚。（酚易溶于氯仿中