1、從組織器官分離細(xì)胞從組織器官分離細(xì)胞一、非酶分離細(xì)胞方法(一)機(jī)械分離法 適用于較柔軟的組織，如腦、肝、脾、淋巴結(jié)、胸腺、胚胎組織、腫瘤組織等。1組織研磨法：操作方法：(1) 取消毒的碟皿(直徑5 8cm或略大)，放入少許Hanks液或PBS;(2) 將采取的小塊組織先用PBS漂洗去組織表面的血污，剪成撕去 附帶的其它組織，如脂肪或多余的纖維、包膜等，切成 5mm3左右 大小的小塊，放入碟皿內(nèi) Hanks液或PBS中；(3) 用鋒利手術(shù)刀或眼科剪將組織剪切成 1mm3左右的碎組織塊；(4) 將碎組織及Hanks液或PBS置于較松的組織研磨勻漿器內(nèi)，用 手緩慢研磨(可反復(fù)幾次)，形成散在細(xì)胞的勻

2、漿。(5) 將組織勻漿經(jīng)40目或100目不銹鋼網(wǎng)過濾去除纖維組織、血管 及較大的凝塊。過濾時(shí)可用 Hanks液或PBS沖洗；(6) 將過濾的細(xì)胞勻漿懸液直立靜置片刻使較大的組織塊及紅細(xì)胞 先沉淀，取上部細(xì)胞懸液，以 Hanks液或PBS洗滌，離心，收集細(xì) 胞；(7) 計(jì)算活細(xì)胞率，計(jì)數(shù)細(xì)胞，制備成所需濃度的細(xì)胞懸液。注意：組織研磨勻漿器不能太緊，研磨時(shí)應(yīng)緩慢，否則易使細(xì)胞 損傷、破碎、或增高死亡細(xì)胞率。2不銹鋼網(wǎng)擠壓法：操作方法：(1) 將切取的組織塊以PBS漂洗去表面血污，切成510mm3的組 織塊；(2) 在消毒碟皿內(nèi)放少許 Hanks液或PBS，把40目100目的不銹 鋼網(wǎng)放入Hanks

3、液或PBS中，將組織塊置網(wǎng)上，用消毒注射器芯或 試管的底端輕輕壓擠組織，使其穿過網(wǎng)眼入 Hanks液或PBS中。同 時(shí)，用Hanks液或PBS沖洗網(wǎng)上的組織。最后，將網(wǎng)上剩余的纖維 包膜或血管等棄去；(3) 收集Hanks液或PBS液中的細(xì)胞懸液顯微鏡檢查，如仍有較多 的小組織塊，可用更細(xì)的不銹鋼網(wǎng)(20呵)重復(fù)壓擠1次；(4) 收集Hanks液或PBS細(xì)胞懸液。1000r/min離心片刻使殘留較大組織碎塊及紅細(xì)胞沉淀，吸取未沉淀的細(xì)胞懸液。再以Hanks液或PBS洗滌，離心，收集1次；(5) 計(jì)數(shù)活細(xì)胞率及計(jì)算細(xì)胞數(shù)，制備所需濃度的細(xì)胞懸液。注意：如經(jīng)1次壓擠尚有較多的碎組織塊，也可用消毒注

4、射器， 帶6號(hào)注射針頭，將細(xì)胞及碎組織從注射器內(nèi)經(jīng)針頭壓出，使細(xì)胞 再次分散。3吹打分離法：此法只適用于很松軟的組織，如從腦組織分離膠質(zhì)細(xì)胞。操作方法：(1) 取小塊腦組織，剝離腦膜，血管等纖維組織后，用Hanks液漂洗2次；(2) 在消毒碟皿中放約2 3倍于腦組織的Hanks液，將腦組織置 Hanks液中，用滴管吸取Hanks液反復(fù)吹打腦組織使成懸液；(3) 將組織懸液經(jīng)40目尼龍網(wǎng)過濾后，移入試管中直立靜放510分鐘，較大的組織碎塊及紅細(xì)胞下沉，脂肪及碎細(xì)胞片等漂浮在液 體上部。吸取中間部分的細(xì)胞懸液，并如此反復(fù)23次；(4) 取少許細(xì)胞懸液顯微鏡檢查，如已制成較多的散在細(xì)胞懸液，可計(jì)數(shù)活

5、細(xì)胞率。計(jì)數(shù)細(xì)胞用 Hanks液或適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液制備成所需 濃度的細(xì)胞懸液。(二)EDTA 分離法 EDTA(ethylenediaminetetraaceticacid),是一種 螯合劑(chelatingagent),能與組織內(nèi)的Ca2+、Mg2+離子螯合而使細(xì) 胞分離。EDTA常用PBS等配成0.02%的工作液。其作用溫和，在一般情 況下對(duì)細(xì)胞損傷較小，但分離效果并不很高?？捎糜诜蛛x一些胚胎 組織或肝臟灌流，不過較少單獨(dú)使用，常和其它一些酶(如 0.25%胰蛋白酶)混合使用(以1 : 1或2 : 1混合);但不要與膠原酶混合使用， 因這種酶依賴Ca2+和 Mg2+，與EDTA混合后可使膠原

6、酶的消化作 用嚴(yán)重障礙或失效。與胰蛋白酶混合可用于分離培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行傳代 培養(yǎng)。其方法是將培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)液吸去后，加入0.02%EDTA與0.25%胰蛋白酶的混合液，以蓋滿細(xì)胞為度，處理310分鐘，注意不能消化過度使細(xì)胞收縮脫落。吸出消化液，立即用Ha nks液洗滌23次以洗去EDTA。最后加入培養(yǎng)液，用滴管吹打使細(xì)胞脫落形 成細(xì)胞懸液。使用EDTA應(yīng)注意分離時(shí)間不能過長。因其對(duì)細(xì)胞的線粒體可有 損傷，而且細(xì)胞長時(shí)間處于無 Ca2+環(huán)境下(被EDTA螯合)則可使細(xì) 胞內(nèi)K+降低;同時(shí)呼吸減弱也可造成細(xì)胞損害。(三 )其他非酶分離細(xì)胞方法甘氨酸(glyc ine)也可用于分離細(xì)胞，如用含1mol/

7、L甘氨酸與2mol/LEDTA的混合液分離海膽胚胎。雙糖 (disaccharides),如高張蔗糖、乳糖、麥芽糖等(常用0.5mol/L)可分離 細(xì)胞間的縫隙連接或緊密連接等。0.5%KOH的稀堿溶液(pH9.3左右) 也可用于胚胎組織的分離。但如將 pH恢復(fù)正常，則分散的細(xì)胞又 可再聚合。二、酶分離細(xì)胞技術(shù)可用于分離細(xì)胞的酶很多。蛋白水解酶類有胰蛋白酶(trypsi n)、膠原酶(collagenases)彈性蛋白酶(elastase)鏈霉蛋白酶(pronase)溶 菌酶(lysozyme)、木瓜蛋白酶(papain)等。其它酶類有透明質(zhì)酸酶 (hyaluronidase),脫氧核糖核酸酶

8、(deoxyribonuclease等。這些酶各有 優(yōu)缺點(diǎn)，對(duì)細(xì)胞的損傷也各不相同，所以對(duì)使用何種酶應(yīng)按實(shí)驗(yàn)要 求加以選擇。比較常用的有胰蛋白酶、膠原酶、鏈霉蛋白酶、透明 質(zhì)酸酶等。胰蛋白酶適于消化間質(zhì)較少的組織，如胚胎組織、羊膜、上皮、 肝、腎等;對(duì)纖維性組織的消化能力較差。Ca2+、Mg2+對(duì)其活性有 抑制作用，故配制時(shí)應(yīng)不含 Ca2+或 Mg2+，或與EDTA配伍使用。胰蛋白酶的工作濃度為0.01%0.5%，常配成0.25%的工作液。室 溫及37C下消化比較恰當(dāng)，4C時(shí)仍有緩慢的消化作用。最適工作 pH為89左右。消化時(shí)間最短（如胚胎組織）為2030分鐘，一般 為3060分鐘，低溫或低濃

9、度時(shí)也可延長至 1218小時(shí)（過夜）。膠原酶適用于消化分離纖維組織，對(duì)上皮、肝、胰、腎及一些癌 組織的細(xì)胞分離也比較適用。它有很多類型，Sigma廠的產(chǎn)品有1V、忸、幻等型，分別適用于分離肝細(xì)胞、胰島、脂肪細(xì)胞或 一般纖維組織，應(yīng)按實(shí)驗(yàn)要求，按產(chǎn)品說明書選用。膠原酶與胰蛋 白酶不同，它必須在Ca2+及Mg2+存在的條件下，才能較好地活 化。常用的濃度為100200U/ml（按說明書配制。一般產(chǎn)品 >125U/mg，故工作濃度常用0.05%0.1%，高純度膠原酶可為 >1200U/mg或10003000U/mg）。該酶的作用緩慢，常需較長的 消化時(shí)間。鏈霉蛋白酶為非特

10、異性具有廣譜性質(zhì)的中性蛋白酶，適于分離消 化道的粘膜上皮細(xì)胞及肝臟的 Kupffer細(xì)胞。其消化速度比胰蛋白酶 快。分離的消化道上皮存活率可高達(dá) 96%左右，較其它酶優(yōu)越。透明質(zhì)酸酶對(duì)間質(zhì)中含多量透明質(zhì)酸的組織比較適用，對(duì)熱穩(wěn) 定，工作pH較寬，常可與其它酶配合使用以增加消化分離細(xì)胞的 效果。（一）胰蛋白酶消化分離細(xì)胞方法操作方法：1. 在消毒碟皿中將組織剪切成 35mm3左右的碎組織塊；2. 在小燒杯內(nèi)放入3050倍的0.25%胰蛋白酶，加入剪切碎的組 織，在37C水浴或溫箱中消化3060分鐘，每隔5分鐘左右搖蕩1 次（用電磁攪拌器拌攪亦可）；3. 將消化的組織離心1000r/mi n10分

11、鐘，吸去上清液，以Ha nks液 漂洗23分鐘，再離心，去上清，重復(fù) 3次以盡量洗去胰蛋白酶；4. 用100呵尼龍網(wǎng)或不銹鋼網(wǎng)過濾，去除未消化分離的碎組織 塊、纖維等；5再以Hanks液漂洗，收集細(xì)胞懸液；6.計(jì)數(shù)活細(xì)胞百分率，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)，用含 4%小牛血清的PBS或Hanks液制備所需濃度的細(xì)胞懸液（加小牛血清不僅可以作為穩(wěn)定 劑，抑制分散的細(xì)胞凝聚；也可作為酶抑制劑，抑制與細(xì)胞表面結(jié)合 的胰蛋白酶的消化作用）。（二）膠原酶消化分離細(xì)胞方法操作方法：1. 將切取的組織先用Hanks液或PBS洗凈粘附的血污。在碟皿內(nèi) 剪切成35mm3碎組織塊；2. 在小培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)加45ml培養(yǎng)液，放入數(shù)小塊組織碎塊，加入等量0.1%的膠原酶（終濃度約為100U