1、微生物培養、藥敏試驗的流程及意義一、微生物培養及藥敏試驗的總述微生物培養就是使用體外試驗的方法檢測可能導致感染的病原菌，并 給以藥敏結果，為臨床醫生針對某一特定的臨床感染提供依據。而藥敏試 驗則是承接微生物培養的一項工作，即對于培養得到的病原菌進行體外試 驗檢測細菌對于抗菌藥物的耐藥性，來預測抗菌藥物的臨床治療效果，從 而為臨床醫生提供選用抗菌藥物的依據來治療感染。對于檢測到的可能的致病菌進行藥敏試驗時選擇的藥物是參照美國的 CLSI推薦的標準制定的。尤其，使用全自動微生物分析儀進行藥敏試驗時 有固定的藥敏組合，不是人為可以隨意添加或減少的。（一）微生物的培養和藥敏試驗的流程基本為：將標本進行

2、處理（不是所有的標本都需要處理）；將標本接種于不同的培養皿中在不同條件的培養箱中進行培養（不 同的標本所含菌的種類不同，不同菌的生長條件不同，因此需要接種于不 同的培養皿中）；24h后觀察培養皿中細菌的生長情況：a.此時若無細菌培養，繼續放回培養箱中培養24h,若仍然無細菌生 長則判定為陰性結果，因此陰性結果出具的時間為48h以后。b.若有細菌生長，要根據形態和氣味等對細菌進行初步的判定，若能 判定出細菌的種類，則進行相應的藥敏試驗。貼有藥敏片的培養皿在培養 箱中培養24h后進行藥敏結果的解讀，然后報告結果，這種微生物培養及 藥敏結果報告出具的時間就是48h以后。由于不同的細菌的生長的速度不同

3、，有些細菌在培養24h后不能完全 判定結果甚者24h培養后無法觀察到明顯的細菌生長的則需要繼續培養 24h,即連續培養48h后同樣根據菌落的形態、氣味等來觀察判定細菌的 種類然后進行藥敏試驗。這種微生物培養和藥敏試驗結果出具需要72h以 后。而血液、骨髓等標本則是利用不同于上述培養方式的方法進行培養。 它有專門的培養瓶和儀器。這種儀器會自動監測培養瓶中的變化來判定有 無細菌生長，若有細菌生長儀潛會發出警報。在培養5天內任何時間發出 警報的培養瓶都要抽取瓶中的物質在培養皿中進行接種培養，同樣在菌種 鑒定后進行藥敏試驗；若在培養5天內不發出警報的培養瓶則視為陰性結 果。因此血培養出具結果的時間為5

4、7天。菌落的鑒定需要有雄厚的工作經驗和熟練的相關基礎知識。常規鑒定 的方法有形態特征和理化特性。形態特征包括顯微形態和培養特征；理化 特性包括營養類型、碳氮源利用能力、各種代謝反應、酶反應和血清學反 應。在微生物室學習時發現，很多時候在不太確定細菌的種類時，檢驗人 員也會結合理化特性來判定細菌種類。（二）革蘭氏染色、應用及意義由于微生物的生長有時間限定，因此微生物培養和藥敏試驗沒有急查 的說法。最快的結果也只能是通過涂片來判定有無細菌生長和細菌染色后 的顏色和形態，來給臨床醫生的用藥提供依據。革蘭氏陽性菌和陰性菌因為細胞壁的結構不同，在革蘭氏染色時染成 不同的顏色。革蘭氏陽性菌顯示紫色、革蘭氏

5、陰性菌顯紅色或粉色。由于 細胞壁的結構不同，導致這兩類細菌在染色性、抗原性、毒性、對某些藥 物的敏感性等方面均有較大差異。一般情況下，大多數化膿性球菌都屬于 革蘭氏陽性菌，它們能產生外毒素使人致病，而大多數腸道菌多屬于革蘭 氏陰性菌，它們差生內毒素，靠內毒素使人致病。在治療上，大多數革蘭氏陽性菌對青霉素敏感（結核桿菌對青霉素不 敏感），革蘭氏陰性菌對青霉素不敏感（但奈瑟氏菌中德流行性腦膜炎雙 球菌和淋病雙球菌對青霉素敏感），而對鏈霉素、氯霉素等敏感。所以區 分病原菌是G' G',在選擇抗菌藥物方面意義重大。常見的G-有：葡萄球菌、鏈球菌、肺炎雙球菌、炭疽桿菌、白喉桿菌、 破傷風

6、桿菌等； 常見的G-：大腸桿菌、變形桿菌、痢疾桿菌、肺炎桿 菌、布氏桿菌、流感（嗜血）桿菌、卡他（摩拉）菌、不動桿菌屬、那爾 森菌屬、嗜肺軍團菌、百日咳桿菌、副百口咳桿菌、志賀菌屬、巴斯德菌 屬、霍亂弧菌、副溶血性桿菌、類志賀毗鄰單胞菌等。涂片的原理就是將標本固定于玻璃片上，并進行革蘭氏染色，然后在 顯微鏡下觀察染色情況和細菌的形態。是若有細菌生長，也只能判定是革 蘭氏陽性菌或者是革蘭氏陰性菌。涂片是一種粗略的、快速的細菌鑒定的 途徑。經常被輔助用于細菌種類的鑒定，雖然通過這種方法無法給予具體 的細菌的種類及藥物耐藥性。但是對于臨床醫生用藥可以提供一個大致的 方向。微生物標本有帶菌體液和無菌體

7、液兩種類型。帶菌體液包括：痰、鼻 咽拭子、尿液、糞便等；無菌體液包括血液、骨髓、腦脊液、關節腔積液、 心包積液、胸腔積液、鞘膜積液、胸腹水等。在排除采集標本或其他操作 過程污染之后從患者血液等無菌體液中檢出的細菌一般都應視為病原菌。二、藥敏試驗結果的解讀藥敏試驗為臨床抗菌藥物的選擇有指導意義，正確地解讀藥敏報告單 將會幫助我們更好地利用藥敏結果來選擇合理的藥物及合適的劑量等。不同細菌進行藥敏試驗時選用的抗菌藥物是根據美國CLSI標準來配 備的。不同的藥物會使用不同的藥物組合，但總體上該標準將所選藥物分 為以下幾類：-A組：首選，常規試驗和報告-B組：首選抗生素，在下列情況下選擇使用- 細菌對A

8、組抗生素耐藥- 病人對A組抗生素過敏- 嚴重感染或多部位、多種細菌混合感染- 控制傳染病流行C組：備選抗生素，在下列情況下使用- 對一個或多個首選藥耐藥的地區流行株感染- 對不常見菌感染的治療- 控制傳染病的流行-U組：包含某些僅用于或首選治療泌尿道感染的抗菌藥物因此，同一張藥敏報告單中包含的藥物有A組、B組甚至可以有C組 和U組；不同的標本檢出同樣的細菌，藥敏報告單中的藥物也不會相同。 關于藥敏報告單的解讀，常見的問題及答案如下：1、我們想用的藥物在藥敏試驗中沒有做？可能是天然耐藥可能是藥物的敏感性被其他藥物所預報2.為什么有的菌報告很多種藥物，有的僅報告幾種藥物？報告的藥物種類根據細菌種類

9、的不同而有所不同，如銅綠假單胞菌報 告的藥物較多，而嗜麥芽窄食單胞菌報告的藥敏較少。3、是否能將所用的藥都做藥敏試驗？沒有必要：通過耐藥機制和標志性藥物可以預測其他抗菌藥物的敏 感性沒有可能：不是所用藥物都可以做藥敏試驗（需要藥物在體外穩定, 需要有操作標準和解釋標準）4、在藥敏試驗報告中MIC越小的抗菌藥物效果越好嗎？如何根據MIC 聯合用藥？感染菌對同一種藥物的MIC越小，效果越好；不同種抗菌藥物之間MIC無可比性；目前很多儀器報告的是檢測折點，而不是真正的MIC。5、培養陽性的細菌都需要用抗菌藥物治療嗎？不是的；培養陽性感染，可能為污染（血培養），可能為定植（痰培養）；任何結果必須結合臨

10、床情況進行評價（很重要）；感染部位的清創、引流、換藥比使用抗菌藥物更加重要；改善患者全身情況：落官功能支持，糾正酸堿平衡，電解質紊亂， 低蛋白血癥，高血糖等。6、選擇藥敏報告敏感的藥物，為什么臨床治療無效？體外藥敏試驗只能預測體內治療效果，并不等同；一般來說，耐藥 =治療無效；敏感/治療有效；可能不是真正的致病菌（污染或定植菌）；細菌本身因素（如誘導耐藥，生物被膜）；感染部位及藥代動力學因素；細菌的MIC,給藥劑量和用藥方式；藥敏試驗藥物中有些藥物單獨使用無效，但可以及其他藥物聯合用 藥；藥物劑型及生物利用度（純品、商品）。7、涂片鏡檢結果及培養結果不吻合？涂片鏡檢是報告所有檢見的細菌，而培養

11、的目的是檢出致病菌，因 此會產生涂片和培養結果不一致的情況；一些苛氧菌需在特殊的環境或培養基上才能生長，因此可能在培養 后才能得到。8、取的明顯就是膿液標本，為何鑒定報告為無菌生長？我們做的是有氧培養，膿液可能為厭氧菌感染。可能細菌被大量的中性粒細胞吞噬。9、鑒定結果明明寫著四聯球菌、革蘭氏陽性桿菌，為何沒有藥敏結 果？四聯球菌為微球菌，一般不引起人體致病，為非致病菌，故考慮污 染可能;藥敏結果參照CLSI標準，目前革蘭氏陽性菌沒有參照標準，故暫 不能做藥敏試驗，若需治療可參照陽性球菌用藥。10、一般培養不是三天出結果嗎，今天第四天了怎么還沒出來？一般培養經48小時后，即第三天出報告，若需分離

12、致病菌的則第四 天出報告。11、今天的培養結果怎么及前天的不一樣？取材是否規范。痰標本，有時選優勢菌做，就可能導致兩次不一樣。12.明顯稀便，培養結果為何正常？大便普通培養，通常只能鑒定志賀菌、沙門菌感染，致病性大腸桿 菌我們沒有鑒定血清；懷疑霍亂時，需開霍亂弧菌培養；可能病毒感染（輪狀病毒）o三、微生物標本及常見致病菌1 .血液標本血液標本的細菌培養是診斷菌血癥或敗血病的基本方法。正常人的血 液是無菌的、如從患者血液中檢出細菌一般應視為病原菌（排除采集標本 或具他操作過程污染），提示有菌血癥或敗血癥，或心內膜炎、心包炎、 血源性骨髓炎。常見的病原菌主要有金黃色或表皮葡萄球菌、鏈球菌（A、 B

13、群，肺炎鏈球菌等）、腸球菌、產單核細胞李斯特菌、腦膜炎奈瑟菌、傷 寒及副傷寒沙門菌和厭氧菌等。2 .骨髓標本正常人的骨髓是無菌的。若從患者骨髓中檢出細菌（排除污染），提示 細菌性骨髓炎或菌血癥、敗血癥。常見病原菌同血液培養。檢驗方法和報 告方式同血培養。3 .腦脊液標本腦脊液的細菌學檢查對于細菌性腦膜炎的診斷有重要的臨床價植。正 常人的腦脊液是無菌的，檢出細菌提示有細菌性（急性化膿性、結核性等） 腦膜炎。常見的病原菌主要有腦膜炎奈瑟菌、流感嗜血桿菌、鏈球菌（A、 B群和肺炎鏈球菌）、葡萄球菌、產單核細胞李斯特菌、結核分枝桿菌等。4 .痰標本痰標本的細菌學檢查對于呼吸道感染的診斷有重要意義。下呼

14、吸道的 痰液是無細菌的，而經口腔咳出的痰帶有多種上呼吸道的正常寄生菌（如 草綠色鏈球菌）。若從患者痰標本中查見致病菌或條件致病菌，提示有呼 吸道細菌感染。常見的病原菌主要有肺炎鏈球菌、A群鏈球菌、金黃色葡 萄球菌、卡他布蘭漢菌、白喉捧狀桿菌、結核分枝桿菌、腦膜炎奈瑟菌、 流感嗜血桿菌、腸桿菌和軍團菌等。5 .咽拭標本咽拭培養對于上呼吸道的細菌感染有一定的診斷意義。正常咽拭有多 種上呼吸道的正常菌群（如草綠色鏈球菌）。若從患者咽拭標本中查出致病 菌或條件致病菌提示上呼吸道有細菌感染（如急、慢性扁桃體炎，咽炎， 喉炎等）。常見的病原菌主要有金黃色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、化膿性 鏈球菌、微球菌和棒狀

15、桿菌等。6 .泌尿、生殖道標本尿液通常是無菌的或一過性有少量微生物，但是尿道內或尿道周圍皮 膚的菌群會污染尿液標本，從而可能導致錯誤的培養結果。中段尿培養加 計數對于泌尿道感染的診斷有重要價值。細菌培養必須結合菌落計數辨別 是否為病原菌。有致病菌或條件致病菌生長，菌落計數107ml,提示感染 （膀胱炎，腎盂腎炎、腎或膀胱結核等）。常見病原菌主要有大腸埃希菌、 葡萄球菌、鏈球菌、變形桿菌和傷寒沙門菌等。尿標本包括清潔中段尿、 導尿導管尿、經恥骨上皮膚穿刺采集膀胱內尿液。正常的內生殖器是無菌的，而外生殖器（包括男性尿道口和女性陰道） 有多種細菌寄生。查見病原菌提示有細菌感染。常見的病原菌主要有葡萄

16、 球菌、腸球菌、鏈球菌、淋病奈瑟菌、大腸埃細菌、變形桿菌等。7 .糞便標本正常情況下腸道中有多種細菌。引起感染性腹瀉的病原微生物有：細 菌性：產毒素型腹瀉、侵襲型腹瀉、食物中毒、慢性腹瀉；真菌性；病毒 性。8 .穿刺液標本各個部位穿刺液（胸水、腹水、心包液、關節液及鞘膜液等）的細菌學 檢查對于確定該部位是否有細菌感染具有診斷價值。正常穿刺液是無菌 的，若從患者穿刺液中查見致病菌或條件致病菌提示該部位有細菌感染。 胸腔感染的病原菌以結核分枝桿菌多見，其次是金黃色葡萄球菌、溶血性 鏈球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌等;腹腔感染的病原菌以腸道細菌如 大腸埃希菌、糞腸球菌，以及結核分枝桿菌多見。心包炎和

17、關節腔液以金 黃色葡萄球菌、溶血性鏈球菌、大腸埃希菌和銅綠假單胞菌等多見。9 .膿液及創傷感染分泌物標本膿液的細菌學檢查對于確定感染的種類（結核性或非結核性等）、提供 藥物敏感結果、指導臨床治療有重要的意義。化膿性感染可由單種或多種 細菌引起。常見病原菌主要有金黃色葡萄球菌、化膿性鏈球菌和肺炎鏈球 菌、大腸埃希菌、銅綠假單胞菌、變形桿菌和結核分枝桿菌、諾卜菌。以 及梭桿菌和擬桿菌等。四、微生物檢驗標本的正確采集、運送及處理微生物檢驗標本的正確采集、運送及處理，及細菌的培養、鑒定結果 有十分密切的關系，醫生、護士、檢驗人員均應重視微生物標本的正確采 集的有關問題，并有責任向患者及家屬進行正確采集

18、標本的宣傳和指導。（一）微生物檢驗標本采集、運送、驗收1、標本的采集不同的標本在采集時會在技術、方法和量方面的內容有所不同，但是最基本需要遵循的是以下兒項：（1）申請單必須標記清楚姓名、性別、年齡、病原號、標本來源（具 體寫明）、檢查項目（目的要明確）等，以便試驗室能夠合理選擇培養環 境和培養基。（2）盡量在抗生素應用前采集標本、以提高陽性檢出率和避免漏檢。（3）標本采集應嚴格執行無菌操作。（4）采集標本的容潛必須經滅菌處理，不可用消毒劑。2、標本運送（1）標本采集后應盡快運送到細菌室。（2）標本采集后在室溫下超過2小時未送到細菌室的，可視為不合格標本。3、標本驗收（1）實驗室只接受和處理合格

19、標本。（2）實驗室對不合格標本退回必須說明原因、并及時及臨床聯系。4、注意事項（1）微生物檢驗樣本必須要求采集轉運，否則將影響檢查結果，并 給評價其意義帶來麻煩甚至誤導。（2）微生物樣本極易被污染，污染的樣本雜菌大量繁殖抑制病原菌 生長，條件致病菌也是致病菌，如污染條件致病菌將誤導臨床，造成對患 者的損害以及經濟和時間的浪費。（3）某些標本離體極易死亡，應在床邊采取和接種或立即保溫送至 實驗室檢驗。室溫放置或延遲送檢，可使檢出的陽性率降低；不能使用冷 藏的樣本檢驗。（4）厭氧菌樣本采取必須隔絕空氣，混入空氣的樣本影響檢驗結果, 不能使用。（二）微生物檢驗標本處理1、血液及骨髓標本最常用的方法為

20、血液增菌培養法。成人每瓶需810mL,兒童每瓶需 13mL。另外，腦脊液和胸腹水也可用兒童血液培養瓶增菌，采集量同血 液。（1）為了提高陽性率，應在抗生素治療前，病人寒戰或高熱時嚴格無菌靜脈采血后注入血培養瓶。（2）于己用抗生素不能停用時，可于48小時內分別于下次用抗生素 之前，采取3份血液標本（要求雙管雙側）立即送檢，如不能立即送檢， 應放置室溫保存，但不能超過89小時。（3）必要時可取骨髓12mL,無菌注入血培養瓶中送檢。注意：應嚴格無菌操作避免污染。一般病人在發病初期12天或發 熱高峰時采集血液保本。2、痰及下呼吸道標本注意事項：痰經過口腔，所以患者應用清水漱口數次，盡量排除口腔 內大量雜菌。（1）自然咳痰法：以晨痰為佳，用冷開水漱口后用力深咳出肺部的 痰，吐至無菌容器中送檢，痰量不得少于1mLo（2）小兒取痰法：用彎壓舌板向后壓舌，將拭子深入咽部，小兒因 壓舌板刺激引起咳嗽，噴出的肺或氣管分泌物粘在拭子上即可送檢。（3）支氣管、支氣管穿刺、支氣管肺泡灌洗等采集法，均由醫生操 作。其中氣管導管法：氣管插管吸取下呼吸道痰液。（4）呼吸道標本采集方法：鼻咽拭子法，清水漱口后，用壓舌板壓 舌根，用棉拭子在病人咽后部涂抹數次，放入無菌管中