1、分子標記在番茄抗性育種中研究進展摘要：本文綜述了近年來 RFLP RAPD SSA AFLP CAP序口 SNP分子 標記技術在番茄抗性育種上的應用， 分析了目前的研究進展，對今后 研究的重點進行了討論。關鍵詞：分子標記；番茄；抗性；進展。Molecular marker in tomato resistance breeding researchprogress inAbstract: This paper reviewed recent RFLP RAPD SSA AFLP CAPS and SNP in the application of tomato resistance breed

2、ing, analysis of the current research progress, the focus of the future research are discussed.Key words: Molecular markers; tomato; resistance; progress.番茄既是蔬菜也是水果，其中含有豐富的維生素C 寸心血管有良好 的保護作用；番茄紅素具有良好的抗氧化作用，能清除體內廢物，增加 免疫力。它也是營養師大力提倡的減肥食品。它早已成為人們日常生活中的不可缺少的食物。隨著遺傳學的發展，遺傳標記的種類和數量也在不斷增加。形態標 記、細胞學標記、生化標記

3、都是以基因表達的結果（表現型）為基礎，是對基因的間接反映；而DN齡子標記則是DN水平遺傳變異的直接反 映。與表型標記相比，DN盼子標記具有能對各發育時期的個體、 組織、 器官甚至細胞作檢測，既不受環境的影響，也不受基因表達與否的限 制；數量豐富；遺傳穩定；對生物體的影響表現“中性”以及操作簡便 等特點。分子標記的所有這些特性，奠定了它具有廣泛應用性的基礎。 本文在介紹一些常用的DN圖子標記技術基礎上，綜述分子標記應用 于番茄遺傳育種研究的新進展，并就我國今后番茄分子育種主要研究 方向進行討論。1 .分子標記的介紹分子標記的概念：廣義的分子標記是指可遺傳的并可檢測的DNA序列或蛋白質。狹義分子標

4、記是指能反映生物個體或種群間基因組中 某種差異的特異性DNAt段。在番茄遺傳育種研究工作中使用的DN份子標記主要涉及基于 Southern雜交的限制性片段長度多態性標記（RFLP基于PC肢術的 DNAr增方法的隨機擴增多態性DN標記（RAPD）,簡單重復序列標記 （SSR）、以及基于PC而酶切相結合的擴增片段長度多態性標記 （AFLP）、切割擴增的多態性序列標記（CAPS和單核甘酸多態性（SNP） 等。2 .分子標記基本原理RFLP限制性片段長度多態性，restriction fragment length polymorphism,簡稱RFLP）g本原理是：植物基因組DNA5限制性內切 酶酶

5、切后，通過電泳將大小不同的酶切片段按照各自的長度分離，通過Southern吸印與標記的探針雜交，放射自顯影檢測酶切片段的多態 性，此方法穩定可靠。RAPD隨機擴增的 DN能態，性，random amplified polymorphic DNA, 簡稱RAPDM以基因組總DNM模板，利用隨機引物對模板進行PCIT 增得到多態性DN附段，然后通過電泳檢測片段的多態性，以此來診斷 生物體內在基因排布與外在性狀表現規律的技術。它基于PCR無需預先知道DN序列信息。簡單重復序列（simple sequence repeats,簡稱SSR僅叫微衛DNA（ microsatellite DNA）。所謂微衛

6、星是由2 6bp的重復單位串聯 而成,一個微衛星長度一般小于100bp,不同品種或個體核心序列的重 復次數不同，但重復序列兩端序列多是保守的單拷貝序列，通過PCr 增其間的核心微衛星DN序列，利用電泳分析不同基因型個體在每個 SSR&點上的多態性。AFLP（擴增片段長度多態性，amplified fragments length polymorphism,簡稱AFLP）原理是把限制性酶切片段通過PCRi應進行 擴增,再把擴增好的酶切片段通過聚丙烯酰胺凝膠等高分辨率的分析 膠電泳，最后檢出片段的多態性。切割擴增的多態性序列標記（cleaved amplified polymorphic

7、sequence,簡稱CAPS技術利用PC時RFL標記進行了轉化，CAP/術 與AFL彼術相反，它是在先獲得某個位點特異擴增產物的基礎上，再 將該擴增產物進行酶切，電泳檢測酶切片段的多態性。單核甘酸多態性（SNP肢術檢測的是單核甘酸的差異。主要是指由 基因組核甘酸水平上的變異引起的 DN解列多態性，包括單堿基的轉 換、顛倒、插入和缺失等。SNFft基因組內可以人為地劃分為2種形式：基因編碼區的功能性突變，主要分布于基因編碼區(coding region), 故又稱為CSNP遍布于基因組的大量單堿基變異。與以前的一些遺傳 學標記相比較，SNPM有位點豐富、檢驗成本低、檢出率高等優點。同 一位點的

8、不同等位基因之間常常只有一個或幾個核甘酸的差異，因此在分子水平上對單個核甘酸的差異進行檢測是很有意義的。3 .番茄分子標記在抗性育種中研究進展番茄分子標記在番茄抗性育種，耐冷性育種，耐鹽性育種，抗病蟲 害育種，抗病性育種(主要包括晚疫病，煙草花葉病毒，青枯病，斑 萎病)等方面的應用十分廣泛，研究也日趨深入。3.1 在番茄耐冷性育種中的研究番茄是喜溫植物，溫度低于10c時生長發育就受到阻礙，8c時生 長量增加遲緩，5c時生長完全停止，有些品種還會表現出明顯的冷 害癥狀。黃錫志等人利用RFL盼子標記構建了番茄的基因連鎖圖，把 2個抗 冷性基因和3個番茄種子發芽期抗冷性相關的基因在基因連鎖圖上進 行

9、了明確的定位1。趙福寬等人以番茄耐冷性基因系為試材， 從耐冷及冷敏感植株中提 取DN購建耐冷DN觸及冷敏感DNAfe,采用RAP分子標記技術，從280 個隨機引物中篩選出一個在兩池間具有多態性的引物 OPF14用輪回 親本及回交后代的單株DNAJ行驗證，證明了該引物擴增出的特異性 片段是一個與番茄耐冷性相連鎖的RAP標記。從瓊脂糖凝膠回收 OPF1獷增出的多態|i條帶與載體pGEMR_T_Ea連接，并轉入大腸桿 菌DH5，對克隆片段測序表明實際大小為792bp,這為轉化成穩定 的SCA標記奠定了基礎。研究從DN份子水平上了解耐冷性狀的差異， 篩選與番茄耐冷性相關的RAPDb子標記，為番茄耐冷育

10、種提高選擇效 率奠定基礎2。3.2 在番茄耐鹽性育種中的研究中國的北方地區土壤都是鹽堿地，對番茄的生長和產量有著很大程 度的影響，研究人員對番茄進行耐鹽性試驗，以期加速作物耐鹽育種 進程，提高番茄的產量。Saranga等人通過分子標記方法得出來自耐鹽的 L.pennelliiLA716 F2群體的總產量和總干物質含量在鹽脅迫下的遺傳力為 0.30.4 ,試驗結果表明可以通過后代選擇獲得耐鹽新材料。大大的 提高了選出耐鹽品種的育種速度。Monforte等人通過分子標記技術在L.esculentum E9和L.cheesmanii L2的F2群體中鑒定出了一個數量性狀位點，這個數量 性狀位點在鹽的

11、脅迫下能夠對番茄的早熟性起主要影響作用，解釋表型變異的35.6%,這個數量性狀位點在非脅迫下的效應明顯減小，說 明該數量性狀位點在鹽脅迫下控制早熟性，也發現其它微效數量性狀 位點和上位互作效應存在4。3 . 3在番茄抗病性育種中的研究3.1.1. 抗白粉病育種中的研究Huan舞人將易感品種Mongker和抗病品種L.hirsutum G1.1560雜交后的得到的F代、F3弋材料進行PAPDb析，把Ol-1基因定位在RFLP 標記TG15手口 TG16數間。試驗還找到了與抗番茄白粉病基因緊密連鎖 的5個均為共顯性RAP標記，并轉化為SCAR01SCAR10SCAE16SCAR11 和SCAR16

12、SCA標記，這有利于該基因的克隆以及番茄抗白粉病分子 標記輔助選擇系統的建立，這個結果使得需要5至9次回交的傳統育種 方式完成的工作，只需2歆即可完成，大大縮短了育種時間 。衛麗等人對由顯性核基因（RL-4）控制的番茄野生種L.peruvianum 抗白粉病抗性進行了分子標記研究。通過采用F2代群分法，在F2代抗、 感池間隨機篩選了 256對引物，找到了與番茄抗白粉病基因 RL-4連鎖 的6個AFL而記，遺傳距離分別為4.3 , 5.5, 5.5, 5.6, 6.6和 11.9cM6。3.1.2. 抗葉霉病育種中的研究Thoma等禾J用 AFL彼術在 L.esculentum（Cf-9）和 L

13、.pennellii 的F2世代中篩選出了近42 000個AFL睦位，試9獲得了 3個與Cf-9共分 離的AFL而記（M1、M2 M3）,集中于Cf-9基因兩側。對含有Cf-9基 因克隆的質粒再用AFL而記進行分析，得知M仰M盼別位于Cf-9基因 的兩側，相距間隔為15.5cM。Jones等人通過這3個標記為起點，通過 轉座子示蹤子技術將Cf-9基因克隆口。于拴倉等人以9個含不同葉霉病抗病基因的番茄品種為試材，通過 接種鑒定表明，Cf-5、Cf-9、Cf-11和Cf-19基因對中國目前的2個葉 霉菌優勢生理小種均具有較強的抗性。根據Cf-9基因設計引物，擴增Cf-9基因的片段，含Cf-9、Cf

14、-11和Cf-19基因的3種番茄均獲得了 2.7kb的擴增片段。但用限制性內切酶 Taq I對PC產物酶切可以將3種材料明顯區分開來，Cf-9的2個差異酶切片段為1170和460bp;Cf-11的2個差異酶切片段為1100和410bp; Cf-19的2個差異酶切片段 為1210和300bp,從而建立了 3個基因的分子標記。在F2分離群體中驗 證表明，3個基因的分子標記鑒定結果與抗性接種鑒定結果是一致的， 用這些標記可以進行分子標記輔助選擇8。3.1.3. 抗晚疫病育種中的研究番茄的抗晚疫病是番茄生長過程中容易感染的一種病，由兩類不同 的基因控制：一種受單顯性Ph因控制；另受多基因控制，與多種因

15、素 有關，屬數量性狀。已在野生番茄中發現 2個PhS因（Ph1和Ph2）。Chunwongs繇人利J用感病品種CLN657（susceptible）和抗病品種 L3708（resistant） 雜交的F編體對基因Ph-3進行標記，找到1個RFLP 標記TG591（LOD=18,41和2個AFLP該基因與Ph口Ph-2為非等位基因 9 OMoreau人利用Hawaii7996和WVa70雜交的F2代群體，把基因定位 在標記CP10等口TG2338.4cM的范圍內（第10條染色體白長臂上），并 利用BS解體找到了與Ph-2連鎖的AFLPg記。從而構建了 Ph-2區域的 高密度圖譜，為該基因的圖譜克

16、隆奠定了基礎10。3.1.4. 抗煙草花葉病毒病育種中的研究番茄煙草花葉病毒病是番茄發生普遍的，危害嚴重的病害，在番茄中目前已鑒定出了 3個顯性抗病基因Tm-1、Tm-/口Tm-22（或Tm-2a）。Pillen等人利用2112個回交群體，對Tm-2sE域高分辨率遺傳圖譜 進行了構建，在周圍約4.3cM的范圍內定位了 13個RFL標記和RAPDR 記，其中10個標記集中在0.2cM的窄小范圍內，而離Tm-2撮近的兩側 標記僅相距0.05cM。有一個RFL標記(R12)與Tm-2超共分離現象。利 用Tm-斜側遺傳距離為1cMRFL標記，只用兩代就可以獲得導入片 段僅為2cMi勺含Tm-2s因的植

17、株，而用常規方法至少需要100代才能得 到同樣的結果11。Da痔人利用兩個近等基因系Tom-1與DTom/R找到了兩個共顯性 的RAP標記，長度分別為450b曲500bp,并將其轉化為穩定的SCAR 標記，來鑒定分離群體的雜和性和純和性，這為育種工作提供了一種方便、快速的方法。200弭田苗英等人運用RAP鼓術和BSAI,找到 了一個與Tm-2s因連鎖的分子標記OPD201700(7.067cM)2。3.1.5. 抗青枯病育種中的研究番茄青枯病(Ralstonia solnacearum)是一種發生普遍、危害嚴重的 土傳性病害，其病原細菌可在土壤中存活多年，是熱帶、亞熱帶地區 番茄生產上的重要病

18、害。迄今為止尚未找到防止此病的有效藥物，因此進行抗病育種是防治該病的最有效手段。Thoquet等人利用Hawaii7996和WVa70俁交的350琳F3群體和已有 的RFL標記，利用不同的數量性狀位點模型，發現了 2個QR住要分布 在第6條染色體上，為番茄抗青枯病育種提供了方向13。壽森炎等人用番茄高抗青枯病品種" T51A'與高感青枯病品種 “T9230'配制雜交組合，接種鑒定其正反交 F1代及F2代分離群體的青枯病發生情況。結果表明，T51A寸青枯病的抗性屬于細胞質遺傳， 受1對雜合基因加性控制。用64個EcoRI/Msel弓I物組合對“T51A'、“T9

19、230' 2個親本及其F2代抗病和感病基因池進行AFL盼析，共擴增 出約4 200條可分辨的帶，其中2條為穩定的差異。用“T51A'和"T9230' 雜交產生的F2代分離群體對2個特異條帶與目的基因的遺傳連鎖性進 行分析，發現特異條帶AAG/CAT暫定名為RRS-342勺抗青枯病基因緊 密連鎖，二者之間的遺傳距離為6.7cM。將AAG/CA片段回收、克隆和 測序，成功地將其轉化為SCA標記，可以更加方便地用于對番茄青枯 病基因的標記輔助選擇14。3.1.6. 萎病育種中的研究番茄斑萎病(Tomatospotted wilt virus)是一種嚴重的番茄病害之

20、一，通常引起番茄的莖和葉片的發育不良、壞死，造成植株死亡。而 由野生番茄轉移到栽培番茄中的Sw-5s因對番茄斑萎病具有明顯的 抗性。Chagu彝人通過用BSA!和RAP技術篩選與Sw-5連鎖標記，找到了 9 個與Sw-5連鎖的標記，其中標記R儕DR紛別位與Sw-5兩側10.5cM的 范圍內，與Sw-5的距離均為1.1cM,并認為這2個標記都是因種間雜交 隨同Sw-5進入L.esculentum的。他們還把其中的R鼓造成穩定的SCAR 標記15。3.1.7. 茄抗蟲害育種中的研究根結線蟲(Meloidogynespp.)是番茄重要病害之一，隨著保護地蔬 菜面積的增加，特別是日光溫室的大面積推廣，

21、導致根結線蟲危害日 趨嚴重，目前生產上防治根結線蟲的方法雖然很多，但防治效果不理想，不能從根本上解決問題，而培育抗病品種，是經濟有效的辦法。Klein-Lankhorst 等人利用83M713手口83M7138a等基因系（只在Mi和Asp-1位點有差異的群體），找至U了 2個RFL標記（GP7訴口H6A202和3個RAP標記。均與番茄根結線蟲基因緊密連鎖， 并且利用GP7標記能 鑒定具有抗根結線蟲性狀的番茄植株的雜合性和純合性，從而為育種 工作提供了方便16。王孝宣等人將Multiplex-PCR和CAPS勺優點結合起來建立了Multiplex-CAPS技術。這種技術能同時檢測2個、3個或多個

22、CAP標記 的多態性，其效果等同于每個CAP標記的多態性的疊加，重復性好， 分析效率高，降低成本數倍17。李紅雙等人研究應用RAP技術，篩選到一個與番茄抗根結線蟲病基 因連鎖的RAP際記，并將該標記成功地轉化成了 SCA標記，為應用分 子標記輔助育種及為進一步克隆該抗病基因打下基礎18。4 .分子標記在番茄抗性育種中的應用分子標記是隨著生物技術迅速發展的日趨完善，建立在分子水平上的，不受環境因素影響的技術。分子標記技術現今已經廣泛用于各種 試驗研究中。分子標記輔助選擇技術在番茄抗病蟲育種中得到了越來越廣泛的作用。據統計，目前，已找到了與20余個抗病蟲基因連鎖的分子標記。分子標記技術還被用于番茄

23、抗病基因的分離。 據統計，目前已分離 的番茄抗病基因已達9個，其中包括抗細菌性斑點病的Pto基因和Prf 基因，抗枯萎病的I22基因和I22C基因，抗葉霉病的Cf22基因、Cf24 基因、Cf24A基因、Cf25基因和Cf29基因，這些研究對于探討抗病基因的作用機理和提高番茄的抗病性具有十分重要的意義。5,存在的問題與前景以上是近年來人們在番茄分子方面的研究，這些可以讓研究人員對 番茄分子標記方面的進展有了 一定程度上的了解， 研究人員對番茄抗 蟲性和抗病性方面的研究比較多，成果也很普遍，但是在耐寒性，耐 鹽堿，耐熱方面的研究還是比較少，這就要求科研人員的試驗不但要 把重點集中到抗病蟲害方面，

24、還要集中到耐寒抗耐鹽堿方面。當然， 分子標記技術必須依附于常規育種，因此，將分子標記選擇應用于常 規育種計劃，對番茄的生產，具有長遠的意義。參考文獻:1黃錫志,壽森炎,廖乾生.轉基因番茄研究進展.北方園藝，2011 , 3:29-31.2趙福寬,楊瑞，林成，等.番茄耐冷性RAP分子標記的篩選及牛I異片段的克隆.中央民族大學學報(自然科學版,2004,13(1):70-74.3 Saranga Y.Cahaner A.,Zamir D. et al. Breeding tomatoes for salt tolerance:inheritance of salt tolerance and re

25、lated traits interspecific population. Theor. Appl.Genet.1992,84(3-4):390-396.4 Monforte A.J.Asins MJ, and Carbonell E.A. Salt tolerance in Lycopersicon species, IV.Efficiency of marker-as-sisted selection for salt toler-ance improvement.Theor.Appl Genet,1996,93 (5/6):765-772.5 Huang C.C, Cui Y.Y, W

26、engC.R, et al. Development of diagnostic PCRmarkers closely linked to the tomato powdery mildew resistance gene Ol-1 on chromosome of tomato.TAG, 2000,101:918-924.6衛麗，黃曉書，謝慧玲，等.番茄抗白粉病基因的 AFL刖記.河南農業大學學報，2005,(6): 188-189.7葉青靜，楊悅儉，王榮青，等.番茄抗葉霉病基因及分子育種的研究進展.分子植物育種2004, (3):313-320.8于拴倉，柴敏，姜立綱.番茄葉霉病高抗基因C

27、f-9、Cf-11和Cf-19的分子標記.植物病理學 報,2005,(3):286-288.9 Chunwongse J,Chunwongse C,Black L,et al. Molecular mapping of thePh- 3 gene for late Biotechnology,2002,77(3):281-286.10 Moreau P. Thoquet P.Olivier J.et al. Genetic mapping of Ph-2, a single locuscontrolling partial resistance to Phytoph-thora infestansin tomato, Mol.Plant Microb.Interact, 1998,11(4):259-269.11 Pillen K, Ganal M.W, and Tanksley S.D. Construction of a high-resolution genetic map and YAC-con-tigs in the tomato