1、最新流感病毒實驗室PCR檢測技術流感病毒實驗室PCR檢測技術佳木斯市疾病預防控制中心最新流感病毒實驗室PCR檢測技術標本采集 應遵循標準的流感檢測方案 應采集鼻拭子和/或咽拭子，和/或依據標準操作來進行采集。對標本采集者應采取 適當的防護。 對于標本的處理、儲存和運輸應遵照流感病毒A H5N1的操作指南來進行。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術標本采集（一） 主要采集上呼吸道標本 鼻咽拭子：將棉簽平行于上顎插入鼻孔，保持幾秒吸收分泌物。 口咽拭子：拭抹咽后壁和扁桃體部位，避免觸及舌部；迅速將棉簽放入無菌、內裝3-5ml樣本運送液及帶墊圈的螺口塑料管中，在靠近頂端處折斷，旋緊管蓋并密封。 氣管分泌

2、液：收集氣管吸取液或支氣管灌溉液5-10ml放入無菌、帶墊圈的50ml螺口塑料管中，立即密封。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術標本采集（二）血清：采集5-10ml全血放入帶墊圈的螺口管中，不加抗凝劑，待血液凝固分離血清，-20保存，血凝塊滅菌處理后棄掉；采集時間：入院后24小時；14-28天或出院當日。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術采樣液的要求 標本采集后應立即放入適當的采樣液中低溫保存 采樣液應包含有一定量的蛋白質和抗菌素 最佳采樣液：Hanks液，Eagels液,生理鹽水 BD15ML采樣管 拭子是聚脂纖維桿可折斷，不推薦棉拭和木桿最新流感病毒實驗室PCR檢測技術臨床樣本收集的注意事項

3、操作要細心，嚴防標本間交叉污染，要做好自我保護 采集標本要有一定力度 標本采集后應迅速至于冰上或者4以下保存，因為流感病毒對熱很敏感 標本管上寫明：醫院名稱，標本號，患者姓名，性別，采樣日期 標本采集后4保存，盡量在24小時內送到實驗室進行檢測，未能及時進行檢測的 應放-70或以下保存，放置4不應超過4天最新流感病毒實驗室PCR檢測技術臨床標本運輸 臨床標本應按照A 類包裝要求運送，并用干冰運輸。 所有標本應標示清楚。疑似病例標本運送應包含的信息請參照禽流感標本運輸。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術A類感染性物質 指在運輸過程中與之接觸能對健康人或動物造成永久性殘疾或致命疾病的感染性物質。此處

4、“接觸”系指感染性物質離開保護性包裝與人或動物的身體接觸或經呼吸道吸入的情況。 A類感染性物質使人染病或使人和動物都染病者聯合國編號為UN2814，其運輸專用名稱為危害人危害人的感染性物質的感染性物質； 僅使動物染病者聯合國編號為UN2900，其運輸專用名稱為僅危害動物的感染性物質僅危害動物的感染性物質。 最新流感病毒實驗室PCR檢測技術A類感染性物質的包裝與標簽最新流感病毒實驗室PCR檢測技術臨床標本的包裝（1）標本必須放在大小適合的帶螺旋蓋內有橡及圈的塑料管里，擰緊。（2）將密閉后的標本放入大小適合的塑料袋密封；每袋裝一份標本。（3）在采樣管上用油性記號筆做好標記用塑料袋密封。同時填寫人感

5、染豬流感監測病例標本原始登記表，用另一塑料袋密封。（4）將標本密封袋放入專用運輸箱內，放入冰排，然后以柔軟物質填充，內襯具有吸水和緩沖能力的材料。同一患者2份以上的密封標本，可以放在同一塑料袋內再次做密封。所有容器必須有生物危險標識。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術臨床標本運送、接收和保存u根據病原微生物實驗室生物安全管理條例（國務院424號令）的有關規定，人禽流感標本應當由不少于兩人的專人護送，并采取相應的防護措施，不得通過公共電（汽）車和城市鐵路運輸。u標本接受不少于兩人，做好記錄，辦理相關接受手續。u標本保存應設立專庫或專柜單獨保存最新流感病毒實驗室PCR檢測技術實驗室檢測決策 流行早期

6、階段 重點在于控制和預防，此時高靈敏度的檢測手段（如流行株特異性核酸檢測）實優先被選擇的，目的在于發現起始病例或病例群，以便能夠及時地進行抗病毒治療和制定相應的預防策略。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術實驗室檢測決策u流感已經廣泛流行期間 此時的重點在于臨床病例的確認，進而防止在醫院內進一步傳播擴散，因而此時實驗室檢測可以采用免疫熒光、快速抗原檢測（快診）等技術進行病理診斷，并且在有可能的情況下進行耐藥性檢測。 最新流感病毒實驗室PCR檢測技術禽流感禽流感(H5N1)病毒的檢測方法病毒的檢測方法 核酸檢測核酸檢測抗體檢測抗體檢測病毒分離病毒分離抗原檢測抗原檢測HIMNSRH細胞分細胞分離離雞胚

7、分雞胚分離離PCRMDDNASBAIFAELISA膠體金膠體金診斷快速；診斷快速；特異度高；特異度高；靈敏度低；靈敏度低；診斷快速；診斷快速；特異度高；特異度高；靈敏度高；靈敏度高；得不到病毒得不到病毒；特異度高；特異度高；無法進行早無法進行早期診斷；期診斷；金標準；金標準；病毒可用于其病毒可用于其它研究；它研究；需要較嚴格的需要較嚴格的實驗條件；實驗條件；最新流感病毒實驗室PCR檢測技術實驗室檢測方法 推薦的檢測方法 用Real-time RT-PCR 方法檢測豬流行性感冒（ H1N1 病毒）病毒。檢測A 型流感病毒的M 基因、Swine（ H1N1）的HA 基因和NP 基因，以及質控對照R

8、NP 基因 確診豬流感病毒A/H1N1 的唯一可靠的方法是進行病毒分離（病毒分離應在BSL-3 實驗室進行），并且進行部分/全基因測序。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術其他檢測方法 快速流感抗原檢測 可以區分A 和B 型流感病毒，不能區分亞型快速檢測實驗A 型流感陽性的病例符合可能病例的標準 但由于和其它檢測方法相比靈敏度較低，因此，快速檢測陰性結果可能是假陰性，不能作為豬流感感染的最后診斷。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術快診方法的特點 操作簡單 快速（30min） 教過容易判斷和解釋 無儀器設備需求，可用于疫情現場檢測 FluA和FluB 不能進行亞型的鑒別最新流感病毒實驗室PCR檢測技術

9、快診的應用價值 感染病例的處理：輔助流感病例的臨床治療策略和醫院處理方案的制定。 爆發疫情的處理：有助于對爆發疫情的預防控制制度的建立。 公共健康：在流感爆發期間，對于公共場所（如商業區、旅游區）的人群健康，快速診斷將提供有效的信息以供控制方案的制定，提供有效的公共健康建議。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術快診的應用價值 監測：為社會公眾提供流感活動情況的“早期預警”系統。在一些國家快速檢測已經被應用流感的監測形成制度，被用于病毒分離前的標本篩選。但是WHO要求對流感進行抗原分析，不推薦把快速檢測作為監測的單一手段。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術免疫熒光法 免疫熒光試驗可以區分A 和B 型流

10、感病毒。 結果取決于臨床標本的質量，操作技能 由于免疫熒光和其他免疫檢測方法中使用的抗體可能不會和該病毒的靶位點結合，因此會產生假陰性結果，不能作為豬流感感染的最后診斷。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術PCR 雖然在PCR 方法中檢測流感基因的高度保守片段和確診A 型流感的引物也許還可以使用，但目前PCR 診斷試驗中用于A 型流感病毒分型的引物可能不能檢測非人類病毒。最新流感病毒實驗室PCR檢測技術Real-Time PCR 基本原理:指在RT-PCR反應體系中加入熒光基團,利用熒光信號積累實時監測整個RT-PCR進程,最后通過標準曲線對未知模板進行定量或定性分析的方法.熒光基團主要有TaqM

11、an熒光探針和SYBR熒光染料 TaqMan熒光探針工作原理:PCR擴增時,在加入一對引物的同時加入一個特異性的熒光探針,探針兩端分別標記一個報告熒光基團和淬滅熒光基團.探針完整時,報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收;PCR擴增時 ,探針被酶切降解,報告基團和淬滅基團分離,從而熒光監測系統接到熒光信號,每擴增一條DNA鏈,就有一個熒光分子形成,實現了熒光信號的累積與PCR產物形成完全同步最新流感病毒實驗室PCR檢測技術最新流感病毒實驗室PCR檢測技術最新流感病毒實驗室PCR檢測技術最新流感病毒實驗室PCR檢測技術步驟1.病毒核酸提取病毒核酸提取:QIAGEN RNeasy Mini Kit(

12、74104)1.100ul樣品+500ulRLT,混勻靜置5-10分鐘2.加入5UL巰基乙醇和600UL70的乙醇充分混勻3將Rnedsy mini spin柱子置于干凈的2ML收集管，吸出600UL液體加入柱子中，12000rpm,離心15秒，棄液。4吸出600UL液體加入柱子中，12000rpm,離心15秒，棄液。5向柱子中加入700UL Wash Buffer RW1， 12000rpm,離心15秒6從Kit中取一支干凈的2ml收集管，將離心后的柱子移到新的收集管上，加入500ul Wash Buffer RPE（加入44ml無水乙醇），12000rpm,離心15秒7棄液，加入500ul

13、 Wash Buffer RPE液，13000-14000 rpm,離心2分8將柱子移到1.5ml的EP管，加入50ulRnasefree Water，靜置2分912000rpm,離心1分，收集離心液為提取的RNA，立即做實驗或-20保存最新流感病毒實驗室PCR檢測技術 組分組分 體積體積(ul)2x Master Mix 12.5x (n+4)上游引物上游引物 0.5 x (n+4)下游引物下游引物 0.5 x (n+4)QuantiTect RT Mix 0.5 x (n+4)probe 0.5 x (n+4)RNA 5.0 x (n+4)RNase free water Up to 25 x (n+4)引物和探針4對：InfA，swInfA，swH1，RPl反應體系的配置 實驗步驟最新流感病毒實驗室PCR檢測技術反應程序