1、表面等離子體共振表面等離子體共振 儀器介紹儀器介紹1聽雨書屋B表面等離子體共振儀就是應用表面等離子體共振儀就是應用 SPR SPR 原理檢測生物傳感芯片原理檢測生物傳感芯片（biosensor chipbiosensor chip）上配位體與分析物之間的相互作用情況）上配位體與分析物之間的相互作用情況. .2聽雨書屋B下面以瑞典的Biacore3000 型 SPR 儀（右圖所示）為例，簡要介紹這種儀器的構成及工作原理。3聽雨書屋B儀器的主要構造uBiacore3000由工作單元和一臺安裝有 Biacore Control 軟件的電腦組成。u工作單元的核心部件包括光學系統、傳感器芯片、液體處理系

2、統三個主要部分。u其他的組成部分包括LED狀態指示器及溫度控制系統等。u其中，傳感器芯片是最為核心的組件：傳感器芯片提供了產生SPR信號的必需物理條件，并且分子相互作用的研究是在傳感器芯片表面進行的。4聽雨書屋B一、光學系統u 其所利用的生物大分子相互作用分析（Biomolecular Interaction Anaylysis） 技術是基于表面等離子共振(SPR)的物理光學現象的新型生物傳感分析技術.u由于其不必使用熒光標記和同位素標記，從而保持了生物分子的天然活性。u SPR共振角會隨金屬薄膜表面通過的液相的折射率的改變而改變，折射率的變化（RU）又與結合在金屬表面的生物大分子質量成正比。

3、（具體 1000RU 的變化表示傳感片表1ng/mm的質量變化）u 因此，BlA 技術可以通過對反應全過程中各種分子反射光的吸收獲得初始數據，并經相關處理獲得結果。5聽雨書屋Bu用 SPR 檢測器所得的信息可直接來自表面的樣品，也可間接來自能與樣品特異結合的相關試劑，還可以從粗樣品的嘈雜信號中獲得微量待測樣品的特異性信號。 其最低檢測下線為 pg 級 (10-12g)。6聽雨書屋B二、傳感器芯片（sensor chip）u在 BIA 技術中必須首先有一個生物分子偶聯在傳感片上，然后用它去捕獲可與之進行特異反應的生物分子。u將 50nm 至 100nm 厚的金膜固定在一塊玻璃片上，將此玻璃片嵌在

4、一個塑料平板夾里，用一種折射率與棱鏡匹配的聚合物將芯片耦合到玻璃棱鏡上，在芯片表面固定一層較容易與其它生物大分子偶聯的葡聚糖分子層（使用者也可以根據需要選擇非葡聚糖分子層的芯片）而成。（該偶聯過程可由儀器全自動控制。） 最為核心的部件7聽雨書屋B傳感器芯片光波導耦合器件金屬膜分子敏感膜8聽雨書屋B1 1、光波導耦合器件、光波導耦合器件u產生SPR現象必須將光波（消逝波部分）與表面等離子體波耦合并使其發生共振，因此需要使用耦合器件。耦合器件棱鏡型光柵型光纖型光波導型9聽雨書屋B1.1、棱鏡型u用于產生衰減全反射的棱鏡型裝置有Otto結構和Kretschmann結構，二者在結構上的區別主要是棱鏡底

5、面與金屬膜之間是否存在間隙。Otto型結構對此間隙的取值有嚴格要求，在制作和使用上都有一定難度，因此應用的比較少；Kretschmann型結構簡單，制作容易實現且使用方便，較容易達到很高的靈敏度，因此應用也最為廣泛，是SPR傳感裝置最常用的結構。對于Kretschmann結構來說，由于漸逝波需要穿透金屬層，在與被測物接觸的表面激發才能產生表面等離子體波，因此對金屬膜的厚度有嚴格的限制。10聽雨書屋B1.2、光柵型u在光柵的表面覆蓋一層金屬膜，金屬膜與分析溶液接觸，當入射光照射在光柵表面時，反射光將出現散射，如上圖，當某一階(m=0，1，2，)的動量與表面等離子體波的動量相等時，二者發生共振。1

6、1聽雨書屋B1.3、光纖型u光纖型SPR傳感器采用光纖作為光的傳輸媒介，主要有兩種形式：終端反射式和在線傳輸式，其結構如下圖所示。由于光纖的獨特性質，加上這種SPR傳感器的結構緊湊、小巧，很容易實現微區探測、遙測和分布式檢測。目前影響光纖型SPR傳感器的主要問題是制作工藝復雜，成本高。12聽雨書屋B1.4、光波導型u 光波導型SPR傳感器的原理與棱鏡型十分相似，如下圖所示，不同之處在于光波傳輸的媒介由棱鏡變為光波導，在理論上，它可達到的檢測精度也與棱鏡型的相仿。所謂的光波導是光波傳導的材料，能把光束縛在一定區域內傳播。光波導型SPR傳感器有其自身的優點：光波的傳輸途徑可以人為控制；易于實現微型

7、化；穩定性好等。13聽雨書屋B2 2、金屬膜、金屬膜u金屬元素的性質各不相同。因此，選擇不同種類金屬材料作為構成表面等離子體共振的基質膜，將會對 SPR 光譜產生很大影響。SPR 研究的是反射光譜，所以需要在可見光范圍內考慮反射率較高的金屬，其隨波長變化而改變的幅度較小，穩定性要好。故 Au 膜和 Ag 膜是 SPR 中最常使用的兩種金屬薄膜。u從SPRSPR光譜的三個特征參數（共振波長，共振寬度，共振深度）來看，在同樣的條件下，銀膜的共振波長的變化明顯比金膜靈敏，共振深度約大于金膜，共振峰寬明顯小于金膜。uAu 膜的穩定性最好，在 SPR 中具有重要應用價值，尤其適用于銀膜不能使用的體系。1

8、4聽雨書屋Bu金屬薄膜的厚度是影響共振深度的重要因素(見右圖)。隨著膜厚度的增加，共振深度變小，最小反射系數變大；當膜厚度超過一定值時，共振峰將消失。當膜厚在某一數值時，反射光強度近似為零，共振深度達到最大。通過實驗，一般選擇膜厚度為 50nm 左右，最多不超過 100nm。15聽雨書屋B3 3、分子敏感膜、分子敏感膜u 為了滿足分析各種生物體系的要求，多種傳感器芯片應運而生，從各類小分子化合物、多肽、蛋白質、寡核苷酸和寡聚糖直至類脂、噬菌體、病毒和細胞，每一種芯片都必須能提供給科學工作者穩定的基線，高靈敏度，廣泛的再生方法，反復使用性和特別好的重現性。成膜方法：1.金屬膜直接吸附法2.共價連

9、接法（生物素-親和素、葡聚糖凝膠、水凝膠、高分子膜、多肽等）3.單分子復合膜法4.分子印膜技術16聽雨書屋B三、液體處理系統Biacore 3000的液體流路簡圖的液體流路簡圖 自動上樣裝置一體化U型射流器17聽雨書屋B四、溫度控制系統uSPR 信號對于溫度變化非常敏感，所以在整個實驗過程中保持傳感芯片表面的溫度恒定是非常重要的。Biacore 3000 采用 Peltier 元件來控制傳感芯片的表面溫度。如果溫度不穩定，儀器前部面板上的黃色 LED會不停的閃爍。通過預先設定，實驗者可以把溫度控制在4-40之間任意一點。 18聽雨書屋B五、LED狀態指示器 u在儀器前部面板上有 5個 LED 狀態指示器，LED的最顯著特點是使用壽命長，光電轉換效能高，分別能夠顯示儀器不同方面的狀態。 19聽雨書屋Bu 另外，在光源的選擇上，固定波長、改變入射角測量方式的 SPR 裝置多采用 He2Ne 激光器(= 63218nm) 作為光源。用激光器作光源，單色性好，強度高。在部分文獻中發光二極管(LED) 也作為 SPR 的光源，選擇的波長多為 760nm。LED 的單色性也較好，且體積小，價格低，使用壽命長。 u 采用固定入射