1、    雞源芽孢益生菌jm42菌株篩選及抑菌物性質分析    司賀龍+郭云霞+孫志穎+郝慶紅+劉月琴摘要：為了篩選對雛雞腹瀉具有顯著預防作用的芽孢益生菌，采用瓊脂平板擴散法，以大腸桿菌菌株為病源指示菌，從健康雞腸道中篩選到1株具有較強抑菌活性的拮抗細菌jm-42菌株，對該菌株進行形態學、生理生化、16s rdna 序列分析，同時采用有機溶劑萃取和鹽析法對其代謝產物進行提取，對其產物物質種類及性質進行分析。結果表明，jm-42菌株與標準菌株bacillus velezensis的同源性最高，為99.92%，且二者在所構建的系統發育樹上的同一分支上，最終鑒定

2、jm-42菌株為b. velezensis。通過對其代謝產物進行初步分析得出，其拮抗物質為蛋白質，50%硫酸銨鹽析所得到的蛋白質組分活性最強，且對熱及酸堿敏感性較弱，性質比較穩定。關鍵詞：雞；芽孢益生菌；篩選；鑒定；抗菌蛋白：s852.6 文獻標志碼：a：1002-1302（2014）08-0208-04益生菌是指通過攝取適當的量，能夠起到有效作用的活菌，它是通過調節腸道微生物生態平衡，改善腸道防御功能、維護腸道屏障功能的微生態制劑1-2。目前，歐盟等國家均出臺了相應政策、法律來嚴格限制甚至禁止抗生素的使用，作為抗生素功能的替代品，微生態制劑以其無污染、無殘留、促生長并具有提高免疫力、促消化的

3、功能而受到人們的關注。芽孢桿菌可以形成芽孢的兼性厭氧菌，具有很強的抗逆性，而且還可以產生多種消化酶及維生素等營養物質3，且芽孢細菌后期的規模化生產可操作性強，易于推廣應用，因此成為目前微生態制劑的首選菌種。幼齡動物由于生長發育不完全，易受到環境、飼料、疾病的影響，導致一些消化道疾病，為了保證益生菌進入機體內的活性及定植，本試驗從健康雞腸道中篩選對致病性大腸桿菌有顯著拮抗作用的芽孢菌株，并對其抑菌物質進行初步分析，為雞源芽孢益生菌的后期研究奠定基礎。1 材料與方法1.1 試驗材料致病性大腸桿菌，由河北農業大學生命科學學院制藥工程系實驗室保存。1.2 樣品采集新鮮的健康雞腸道，取自河北省清苑縣某肉

4、雞養殖場。1.3 培養基細菌用培養基包括na培養基、nb培養基4；生理生化鑒定用培養基依據鑒定手冊中的方法5進行配制。1.4 試驗方法1.4.1 雞源芽孢桿菌的分離從健康雞新鮮盲腸中取1 g內容物，溶于10 ml無菌水中，80 水浴滅菌20 min。用無菌水10倍梯度稀釋，取適當稀釋梯度的懸液在平板上涂布，每個稀釋度涂布3個平板，37 恒溫箱培養24 h，獲得單菌落。挑取不同形態單菌落轉接到na培養基斜面上純培養，每個平板劃4個菌，編號，記錄。1.4.2 雞源芽孢桿菌的初篩和復篩將不同菌落分別轉接到含大腸桿菌的病原菌平板上，與大腸桿菌對峙生長，置于37 恒溫培養24 h。觀察是否有抑菌圈出現，

5、進而挑選出形成抑菌圈的菌株，置于-4 冰箱保存備用。從初篩的拮抗細菌中選出抑菌活性較高的菌進行復篩。將挑選出來的菌株，以na培養基活化后，接種于nb培養基中，37 、180 r/min搖床培養48 h后，取用0.2 m微孔濾膜過濾除菌的拮抗細菌發酵液約15 l，37 培養24 h，測量并記錄抑菌圈直徑。1.4.3 雞源芽孢桿菌jm-42菌株的種屬鑒定根據菌株的菌落形態特征、菌體形態特征、革蘭氏染色性狀、芽孢染色性狀、有關生理生化鑒別試驗，參照文獻5與伯杰氏細菌鑒定手冊進行屬和種的鑒定。1.4.4 雞源芽孢桿菌jm-42菌株的生理生化鑒定按照相應屬、種鑒定的有關內容進行生理生化鑒定。試驗要求分別

6、進行接觸酶試驗、h2s產生試驗、吲哚試驗、明膠液化試驗、氨基酸脫羧酶試驗、淀粉水解、v-p試驗、m.r試驗、檸檬酸鹽利用和糖、醇發酵等。1.4.5 雞源芽孢桿菌jm-42菌株的16s rdna的鑒定1.4.5.1 雞源芽孢桿菌jm-42菌株基因組dna的提取及其pcr擴增和序列測定取對數生長期菌株的發酵液（培養412 h）750 l至ep管中，4 下10 000 r/min離心 10 min，重復3次。用無菌水振蕩洗沉淀2次（洗殘留的發酵液），4 下10 000 r/min離心10 min。加400 l te（tris-hcl和edta混合液）溶解沉淀。液面下加入20 l溶菌酶（50 mg/m

7、l），輕輕搖勻混合，置于37 溫育過夜，間歇搖動ep管，加400 l ctab，65 水浴40 min。冷卻至室溫，加入400 l酚-三氯甲烷（1 1），輕輕混勻，4 下12 000 r/min離心10 min。移取上清，加入350 l三氯甲烷，輕輕混勻，4 下12 000 r/min 離心10 min。取上清，加入等體積冰凍異丙醇，輕輕搖勻，置于-20 冰箱 14 h，沉淀dna。取出后，12 000 r/min 離心10 min。沉淀以75%乙醇洗2次，風干（至完全去除乙醇氣味），得到dna粗品。純化dna：加入200 l te溶解沉淀，液面下加入rna酶（20 mg/ml），37 保溫3

8、0 min。加入400 l 酚-三氯甲烷（1 1），輕輕混勻，4 下12 000 r/min離心10 min。移取上清，加入350 l三氯甲烷，輕輕混勻，4 下12 000 r/min離心10 min。取上清，加入1/10體積的2 mol/l kac溶液和2倍體積的無水乙醇，置于-20 保藏112 h。取出，4 下 10 000 r/min 離心10 min。用75%乙醇洗2次，風干。加 2030 l te溶解沉淀，于-20 保藏。endprint凡是離心后吸取上清液的步驟，必須使用處理過的槍頭。剪去槍尖2 mm左右，目的是減少對dna片段的剪切力，提高收率。jm-42的基因組dna擴增引物為

9、細菌的16s rdna通用引物，正向引物primera：5-agagtttgatcctggctcag-3，反向引物primerb：5-ctacggctaccttgttacga-3。pcr擴增的條件為：94 預變性5 min；94 變性30 s，57 退火40 s，72 延伸90 s，共32個循環；72 延伸 10 min。得到的pcr產物經試劑盒純化后，送往上海生物工程技術服務有限公司測序。1.4.5.2 雞源芽孢桿菌jm-42菌株16s rdna序列分析及系統發育樹繪制利用blast方式將測定好的jm-42菌株的16s rdna序列與genbank中所有已測定的芽孢桿菌屬16s rdna基因

10、序列進行同源序列分析比對，選取序列相似性高的菌株用clustax 1.8軟件對比序列的相似性，并利用neighbor-joining法構建系統發育樹。1.4.6 雞源芽孢桿菌jm-42菌株的產物性質分析1.4.6.1 溶劑萃取將jm-42菌株活化后用nb培養基進行靜置液體發酵。取48 h發酵液4份，每份100 ml，離心后分別用1/3體積的三氯甲烷、乙醚、乙酸乙酯、正丁醇萃取，萃取液在通風處內自然揮發至干燥，分別用5.0 ml蒸餾水溶解后，用瓊脂打孔擴散法在病原菌平板上測定抗菌活性，在同一平板上同時測定發酵液、萃余液的抗菌活性，并以蒸餾水作為陰性對照、發酵液作陽性對照。1.4.6.2 硫酸銨鹽

11、析取48 h發酵液200 ml，離心后在不斷攪拌情況下緩慢添加硫酸銨30%、60%、80%飽和度，于 4 冰箱沉淀過夜，10 000 r/min離心10 min得沉淀，加 0.01 mol/l tris-hcl（ph值7.4）緩沖液溶解，透析，凍干。用0.01 mol/l tris-hcl（ph值7.4），經0.22 m微孔濾膜過濾，制成10 mg/ml抗菌物溶液，用于拮抗活性測定。用瓊脂打孔擴散法在病原菌平板上測定透析液抗菌活性，在同一平板上同時作蒸餾水陰性對照和發酵液陽性對照。1.4.6.3 粗蛋白穩定性研究將粗提拮抗蛋白用無菌水配成濃度為10 mg/ml的溶液。分別測定粗蛋白對熱、ph值

12、的穩定性和對胰蛋白酶的敏感性，從而初步判斷抗菌物質的穩定性。粗蛋白熱穩定性的測定：將拮抗蛋白的粗提取液分別在40、60、80、100 以及0.1 mpa、121 各處理20 min，然后進行抑菌活性的測定。以常溫處理的蛋白液作對照，25 培養2 d后觀察抑菌結果，并測量抑菌圈直徑，比較分析結果。粗蛋白ph值穩定性的測定：將拮抗蛋白的粗提液與磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液等體積混合，再用0.01 mol/l鹽酸或氫氧化鈉分別調ph值至4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0進行抑菌活性的測定，25 培養2 d后觀察抑菌結果，以瓊脂打孔擴散法，觀察不同ph值發酵液的抑菌效果，比較分析

13、結果。粗蛋白對胰蛋白酶的敏感性：將抗菌粗蛋白提取液分裝于ep管中，1 1加入2 mg/ml胰蛋白酶溶液，以加無菌水的發酵上清液作對照，用瓊脂打孔擴散法，在病原菌平板上選擇合適的間距打孔，作3個平行，在37 恒溫孵育0、0.5、1.0、1.5、2.0 h，觀察經胰蛋白酶處理不同時間的抗菌粗蛋白的抑菌效果，測量抑菌圈直徑作記錄。以上各處理和對照分別用抑菌圈法測定其抑菌活性。2 結果與分析2.1 拮抗細菌的初篩將分離得到的不同特征的耐高溫單菌落經純化后分別與大腸桿菌進行對峙生長試驗，從初篩的70株拮抗細菌中選出抑菌活性較高的20株菌進行復篩。2.2 拮抗細菌的復篩對20株形態不同的活性較高的菌株進行

14、復篩，共分離得到具有較高拮抗作用的菌株5株，其抑菌圈直徑均不小于 11 mm（表1），其中菌株jm-42抑菌圈直徑為14.2 mm，能有效抑制大腸桿菌的生長。3 結論與討論芽孢益生菌作為微生態制劑的一種重要來源細菌，在維護動物腸道健康、促進微生態平衡等方面發揮著重要的作用。芽孢細菌在逆境環境下形成芽孢，在溫度、ph值、營養條件適粗時萌發生長，產生營養物質，發揮其益生作用。但芽孢桿菌在常規動物腸道發揮生理功能，可能是通過與其他微生物相互作用的結果，而非單一的芽孢桿菌在倡導生長代謝造成的7。通過拮抗作用來篩選益生菌，是最直接有效的途徑8。本試驗從雞腸道中篩選出對致病性大腸桿菌具有顯著拮抗作用的菌株

15、，經復篩可以確定，jm-42菌株的代謝產物中含有較高的抑菌活性物質，能產生有效的抑菌作用，經形態學、生理生化、16s rdna序列分析得出雞源jm-42菌株為bacillus velezensis。細菌素是某些細菌產生的具有抗菌活性的多肽、蛋白質或蛋白質復合物9，目前由益生菌中的乳酸菌所產生的細菌素有40余種10。益生菌中的乳酸菌在代謝過程中除細菌素外，還能產生乙酸、乳酸及過氧化氫等具有抑菌活性的物質。因此，為了排除這些非細菌素物質的干擾，本研究利用硫酸銨鹽析對代謝產物進行粗蛋白的分離，結果發現50%硫酸銨對粗蛋白提取量最大，抑菌效果最明顯。因此，證明了jm-42菌株發酵液中提取物的抗菌活性是

16、類細菌素所致，而不是有機酸和過氧化氫所致。jm-42抗菌蛋白在較廣泛的ph范圍內都有較好的抑菌活性，酸堿適應性較強；在外界溫度為40 時抑菌活性最強，但在40100 下抑菌活性稍有減弱，在121 下明顯有所減弱，但在此溫度下仍有抑菌圈出現，說明jm-42抗菌蛋白粗提液具有較好的熱穩定性。20世紀80年代初，hultmark等研究在滯育德惜比古天蠶蛹中利用大腸桿菌誘導時發現一類新型的抗菌蛋白，該蛋白分子量在7 ku，不同于溶菌酶的15 ku，與氨基酸組成相似，具有熱穩定性11，與申吉泓等報道12一致。在用胰蛋白酶處理孵育的過程中仍出現抑菌圈，說明該抗菌粗蛋白對胰蛋白酶不敏感。jm-42作為飼料添

17、加劑應用于飼料中，在動物消化道產生的抗菌蛋白不會被胰蛋白酶降解，能發揮其抗菌作用。抗菌肽成分為易消化吸收的氨基酸，可作為畜禽飼料添加劑取代或部分取代目前飼喂動物所用的抗生素，減少抗生素對動物體的危害。目前，利用酵母產生抗菌肽酵母制劑，在預防及治療仔豬白痢、雛雞白痢方面有明顯效果?？傊?，該蛋白質性質較穩定，耐熱耐酸能力強，對病原細菌有較強的抑制能力，由蛋白類物質或非單一抗菌物質所組成，有關其組分和結構鑒定方面須要進一步研究。本研究結果為益生菌的進一步應用提供技術支持。endprint參考文獻：1shah n p. functional cultures and health benefitsj.

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