1、感受態細胞制備一、 實驗目的1、掌握氯化鈣法制備感受態細胞的原理、方法和技術；2、掌握電轉化感受態細胞的制備原理及方法；3、學習并掌握感受態細胞效價的檢測方法。二、 實驗原理在基因克隆技術中，所謂轉化是指質粒或重組質粒被導入受體細胞，表達相應的選擇標記基因，并在一定的培養條件下，在選擇性培養基上長出轉化子的過程。質粒必須通過轉化進入細菌細胞內，才能進行擴增和表達，從而獲得大量的克隆基因。細菌吸收外源DNA的能力最高時的狀態被稱為感受態細胞。有些種類的細菌在其生長的任一階段都處于感受態，而另一些細菌只有處于某個生長時期時，才會處于感受態,如大腸桿菌。大腸桿菌的感受態細胞制備原理是取對數生長期的細

2、菌處于0，CaCl2的低滲溶液中，菌細胞膨脹成球形，轉化混合物中的DNA形成抗DNase的羥基-鈣磷酸復合物粘附于細胞表面，經42短時間熱沖擊處理，促使細胞吸收DNA復合物，在豐富培養基上生長數小時后，球狀細胞復原并分裂增值，被轉化的細菌中，重組子中基因得到表達。對這種現象的一種解釋是CaCl2能使細菌細胞壁的通透性增強，目前還可以使用電激的方法，通過瞬間的高壓電流，在細胞上形成孔洞，使外源DNA進入胞內，從而實現細胞的轉化。電激轉化的效率往往比化學法高出1到2個數量級，達到1 x 108轉化子每1g DNA，甚至1 x 109轉化子每1g DNA，所以常用于文庫構建時的轉化或遺傳篩選化學法簡

3、單、快速、穩定、重復性好，菌株適用范圍廣，感受態細菌可以在-70保存，因此被廣泛用于外源基因的轉化。物理制備法：電轉法，除化學法轉化細菌外，還有電擊轉化法，電擊法不需要預先誘導細菌的感受態，依靠短暫的電擊，促使DNA進入細菌，轉化率最高能達到109 1010轉化子/g閉環DNA。因操作簡便，愈來愈為人們所接受。轉化后在含抗生素的平板上長出的菌落即為轉化子，根據此皿中的菌落數可計算出轉化子總數和轉化頻率，公式如下： 轉化總數菌落數×稀釋倍數×轉化反應原液總體積涂板菌液體積 轉化率（轉化子數每g質粒DNA）轉化子總數質粒DNA加入量(g)理論上轉化率最高為每微克地標準質粒轉化的

4、菌落數為1*1010三、實驗材料實驗儀器：恒溫振蕩儀、恒溫培養箱、低溫常速離心機、移液槍、錐形瓶、離心管、LB液體培養基、實驗試劑：0.1M CaCl2溶液、含10%甘油的0.1M CaCl2溶液、GYT、三蒸水、10%甘油的水溶液、DH5、Top10、DE3、BL21、液氮、冰水。三、 實驗步驟（一）化學感受態細胞的制備（1）菌種的活化：取-70的冰箱中感受態細胞DH5、Top10、DE3、BL21在LB的平板上進行劃線分離。（2）菌種的前培養：從LB平板上挑取相應的單菌落,接種于10ml LB液體培養基中，37振蕩培養過夜至對數生長中后期。（3）菌種的準備：將該四種菌懸液以1:100的比例

5、分別接種于四個不含有抗生100mlLB液體培養基錐形瓶中,37振蕩培養大約2.5小時至OD=0.40.5。（4）感受態細胞的制備：把上述的錐形瓶放到冰水快速使其冷卻。把100 mL培養液均勻分成兩份到50 mL離心管中，在4、3000轉每分鐘，離心10min。棄去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，輕輕混勻，在冰水中靜置30min。棄去上清液，加入30 mL 0.1M的CaCl2溶液，用巴氏管輕輕吹吸讓沉淀充分混勻，在冰水中靜置30min。從冰水中取出4、3000轉每分鐘，離心10min，棄去上清液并用移液槍輕輕地把多余的液體吸干凈，加入0.5 mL含10%甘油的0.1M CaC

6、l2溶液。用巴氏管輕輕吸起液體打到壁上使沉淀混勻并放置在冰上。把液氮倒到小的塑料盒子里，在離心管架子上擺放好0.5ml離心管，用剪過的移液槍頭進行分裝，每個離心管中分裝40L懸浮液。迅速蓋好蓋子放入到液氮中，使之迅速冷凍，然后放到標有感受態細胞種類、制作者和時間的袋中，-70保存。（二）電轉化的感受態細胞的制備第1、2、3步同化學轉化的感受態細胞的制備過程的1、2、3三步相同。（4）制備感受態細：把上述的錐形瓶放到冰水快速使其冷卻。把100 mL培養液均勻分成兩份到50 mL離心管中，在4、3000轉每分鐘，離心10min。棄去上清液，加入30 mL 三蒸水，用巴氏管吸起液體打到離心管壁上使沉

7、淀充分混勻，在4、3000轉每分鐘下離心10min，倒去上清。重復兩次；再加入30 mL含10%甘油水溶液，在4、3000轉每分鐘下離心10min，重復一次。棄去上清液，加入0.5 mL GYT medium(含有10%Glysiron、0.125%Yeast Extraction、0.25% Trypton)，放置在冰上。（5）準備好成有液氮的塑料盒子和把0.5 mL離心管若干放到離心管架子上，將懸浮的感受態細胞分裝在離心管中，每管40l，迅速蓋好蓋子放入到液氮中，使之迅速冷凍，然后放在標有感受態細胞種類、制作者和時間的袋中， -70保存。（三）效價檢測1、化學轉化：（1）取化學轉化感受態細

8、胞于冰上解凍，同時把標準質粒PUC19稀釋十倍置于冰上。（2）在含有40l感受態細胞的0.5ml離心管中加入1µL稀釋后的標準質粒充分混勻。冰上靜置30min。（3）將離心管置于42干式恒溫器上90s，然后迅速放回冰上，使細胞冷卻23min。（4）向離心管中加入已預熱的無菌LB培養液400µL，再轉移到10ml離心管中，37恒溫振蕩培養4560min。（5）將離心管內容物混勻，分別吸取4.4µL和110µL菌液于含有AMP的LB固體培養基上，用無菌的彎頭玻璃棒輕輕將細胞均勻涂開，將平板置于室溫下直到液體被吸收，倒置平板，在37過夜培養，然后通過菌落數計算

9、效價。2、電轉化:（1）取電轉化感受態細胞于冰上解凍，,標準質粒也置于冰上，同時準備干凈的電擊杯于冰上預冷。（2）在含有40l感受態細胞的0.5ml離心管中加入1µL稀釋十倍的標準質粒，充分混勻。然后轉移到電擊杯中，把電擊杯放在電擊儀上進行電擊（2500V，5ms）。（3）在電擊杯中加入160µL無菌LB培養液（無抗生素），然后充分混勻，吸取于10ml離心管中，置于37恒溫振蕩器中培養4560min.（4）分別取2µL和50µL涂板，涂板操作同化學轉化。（5）平板放到37的恒溫培養箱過夜培養。第二天早上讀取兩個平板的菌落數。四、實驗結果1、電轉化感受態細

10、胞的效價：涂2µL菌液的平板上菌落數為88個，通過計算知道，電轉化感受態細胞的效價為8.8×108。2、化學轉化感受態細胞的效價：無菌落生成，同組的也沒有出來結果。五、討論1、感受態細胞制備及轉化中的影響因素細胞生長狀態和密度: 不要用經過多次轉接或儲于的培養菌，最好從70或-20甘油保存的菌種中直接轉接用于制備感受態細胞的菌液。細胞生長密度以剛進入對數生長期時為好，可通過監測培養液的OD600 來控制。密度過高或不足均會影響轉化效率。質粒的質量和濃度: 用于轉化的質粒DNA應主要是超螺旋態DNA。轉化效率與外源DNA的濃度在一定范圍內成正比,但當加入的外源DNA的量過多或體積過大時,轉化效率就會降低。1ng的標準質粒即可使50l 的感受態細胞達到飽和。一般情況下,DNA溶液的體積不應超過感受態細胞體積的5。 試劑的質量: 所用的試劑,如CaCl2 等均需是最高純度的，并用超純水配制，最好分裝保存于干燥的冷暗處。 防止雜菌和雜DNA的污染：整個操作過程均應在無菌條件下進行, 所用器皿, 如離心管,槍頭等最好是新的,并經高壓滅菌處理,所有的試劑都要滅菌,且注意防止被其它試劑、DNA酶或雜DNA所污染, 否則均會影響轉化效率或雜DNA的轉入, 為以后的篩選、鑒定帶來不必要的麻煩。整個操作均需在冰上進行，不能離開冰浴，否則細胞轉化率將會降低。2、效價檢