1、常用蛋白還原劑1DTT中文名稱為二硫蘇糖醇（ Dithiothreitol ，簡稱為 DTT ），是蘇糖醇的 C-1 及 C-4 位羥基 置換成巰基的化合物。 在生化反應中用做還原劑， 保護蛋白質或酶中的巰基不致氧化而失活。 也常用于還原蛋白質分子中的二硫鍵等。DTT 是一種小分子有機還原劑，化學式為C4H10O2S2 。其還原狀態下為線性分子，被氧化后變為包含二硫鍵的六元環狀結構。二硫蘇糖醇的名字衍生自蘇糖（一種四碳單糖） 。 DTT的異構體為二硫赤糖醇（DTE ）,即DTT的C3-差向異構體。DTT 也常常被用于蛋白質中二硫鍵的還原，可用于阻止蛋白質中的半胱氨酸之間所形 成的蛋白質分子內或

2、分子間二硫鍵。但 DTT 往往無法還原包埋于蛋白質結構內部（溶劑不 可及） 的二硫鍵，這類二硫鍵的還原常常需要先將蛋白質變性 （高溫加熱或加入變性劑，如 6M 鹽酸胍、 8M 尿素或 1% SDS） 。反之，根據 DTT 存在情況下， 二硫鍵還原速度的不同， 可以判斷其包埋程度的深淺。2. B -巰基乙醇英文名稱： Mercaptoethanol，化學式：HOCH2CH2SH，分子量：78.13，是一種具有 特殊臭味的無色透明液體，易燃、易溶于水和醇、醚等多種有機溶劑。3 -巰基乙醇（又稱為2-巰基乙醇、1-硫代乙二醇、2-羥基乙硫醇、3 -硫醇代乙醇）是一 種有機化合物，其化學式為HOCH2

3、CH2SH，英文通用縮寫為 ME或3 -ME。它兼具乙二醇（HOCH2CH2OH ）和乙二硫醇（ HSCH2CH2SH ）的官能團，為揮發性液體，具有較強烈的 刺激性氣味。 3 -ME 通常用于二硫鍵的還原，可以作為生物學實驗中的抗氧化劑。它被廣 泛使用的原因是它的羥基使它能夠溶解于水中， 并且降低它的揮發性。 由于具有較低的蒸汽 壓，它的難聞的情況比起惡臭的硫醇要好得多。2-巰基乙醇可以打開蛋白質中存在的二硫鍵：cysS-Scys+2HOCH2CH2SH宀2cysSH+HOCH2CH2S-SCH2CH2OH ，二硫鍵被打開后可以使蛋白質的四級或三級結構被破壞。由于2-巰基乙醇能夠打開蛋白質的

4、結構，它常常被用于蛋白質分析。而 2-巰基乙醇也常常被用于保護蛋白質中自由的半胱氨酸巰基之間不會錯誤形成二硫鍵。作為還原劑， 2-巰基乙醇常?？梢耘c二硫蘇糖醇（DTT ）或三（2-甲酰乙基）膦鹽酸鹽（TCEP）互換使用。2-巰基乙醇是少數幾種被發現可以延長小鼠壽命的化合物。在微克量級水平上，2-巰基乙醇被觀察到對實驗鼠的生命具有多種可能的正面效應。3. TCEP化學名稱：三（2-羧乙基）膦；英文名稱：Tris（2-carboxyethyl）phosphine （TCEP）;分子量： 250.19。無色透明液體，不溶于脂肪烴，微溶于水，溶于醇、酮、酯、醚、苯、甲苯、二甲 苯等，能與氯仿及四氯化碳

5、混溶，與醋酸纖維素、硝酸纖維素、醋酸丁酸纖維素、乙基纖維 素、聚氯乙烯、酚醛樹脂、聚丙烯酸酯等高聚物相容性好。TCEP 是一種非常有效的硫醇類還原劑， 廣泛用作蛋白質化學及蛋白質組學研究中二硫 鍵的定量還原劑。 該試劑在水溶液中的穩定性和溶解性都很好。 在酸性、 堿性溶液中的穩定 性也不錯。與其他類別的硫醇類還原劑如 DTT 相比， TCEP 不僅是一種高效的二硫鍵還原 劑，而且在某些巰基的交聯反應中不需要除掉。 因而在蛋白質化學及蛋白質組學研究常常優 先選擇 TCEP。TCEP 在很寬的 PH 值范圍內都可以選擇性定量地還原哪怕水溶性很差的烷基類二硫化 合物。通常室溫下反應不到 5 分鐘就可

6、以完成。 TCEP 沒有難聞的氣味，而且在空氣中不怕 氧化。補充：DTT , beta-巰基乙醇，TCEP等是巰基類還原劑。還原劑可以保護蛋白質上自 由的巰基不被氧化， 從而避免蛋白質的聚集或變性。 在結晶實驗中， 一般使用的還原劑工作 濃度是 110 mM 。beta-巰基乙醇是上述三種還原劑中還原能力最差的一個，因為它本身只有一個巰基。它的效果一般只能維持 2 3天。因此，在實驗中要每隔 2-3天補加一次beta毓基乙醇來維 持它的作用。由于 beta-巰基乙醇是揮發性的，因此，可以在池液中加入beta毓基乙醇，禾U用它的揮發擴散到液滴中去。二硫蘇糖醇DTT有兩個巰基基團，其作用能維持 3

7、 7天。DTT的揮發性不像beta-巰 基乙醇那么強， 所以使用時應該直接加入到懸滴中去。 DTT 還可以通過微透析的方法加入。TCEP的還原能力比beta-巰基乙醇和DTT都強，它的作用可以維持 2 3周。TCEP能 使結晶用的緩沖液酸化。與 DTT 類似， TCEP 需要直接加入到懸滴中，因此可以考慮微透 析法。beta-巰基乙醇，DTT，和TECP的作用機制可能不同。像其他添加劑一樣，如果你發現 一類物質對樣品的穩定性和結晶有禾，則可以去篩選這一類物質中最適合你的樣品的一種。 我們建議是，最好這三種還原劑都嘗試一下，去發現最適合的。還原劑可以與金屬離子結合， 金屬離子其被還原， 而還原劑

8、的作用被抑制。 這就使得用 重金屬原子作同晶置換法遇到了麻煩?？梢允褂?EDTA 來避免還原劑被金屬離子抑制。但 是，如果金屬離子是你的樣品蛋白維持活性所必須的，就要小心使用EDTA 了。堿性條件下，beta-巰基乙醇和TECP更穩定，效果要好于 DTT。酸性條件下，TCEP的 穩定性也要好過 DTT。DTT可以使Ni被還原，因此在用 Ni柱純化His標簽的蛋白時要避免使用 DTT，而應 該考慮beta-巰基乙醇和TECP。半胱氨酸也是一種還原劑。 在結晶實驗中， 半胱氨酸局限性很明顯， 那是由于它容易形 成六角形的晶體。但是， 半胱氨酸是一種有效的添加劑， 能帶來明顯的效果，不過需要銘記 它

9、的局限性。如果預期到蛋白會被氧化， 從制備樣品開始就要加入還原劑， 并且在整個流程中要不斷 補加保證其效果。在懸滴法中， 可以在池液里加入還原劑，禾用還原劑的揮發擴散，保證懸 滴中還原性的環境。在確定還原劑和樣品比例時， 需要考慮樣品上自由巰基的數目和樣品濃度。 自由巰基數 目越多，樣品濃度越高，還原劑的用量就越大。含砷化合物與還原劑不能共用。 二甲胂和 二甲胂酸鈉是結晶中常使用的含砷化合物， 它們不能與還原劑共同使用。 其他不能與還原劑一起使用的物質還包括： 硝酸銨，過氧化氫， 高氯酸鉀， 硝酸鈉。 在使用某種物質之前， 應該先查閱 Material Safety Data Sheet (M

10、SDS) 。 4.SDSSDS 是一種陰離子去污劑，它能破壞蛋白質分子之間以及其它物質分子之間的非共價 鍵。在強還原劑如巰基乙醇或二硫蘇糖醇的存在下，蛋白質分子內的二硫鍵被打開并解聚成多肽鏈。解聚后的蛋白質分子與SDS充分結合形成帶負電荷的蛋白質 -SDS復合物，復合物所帶的負電荷大大超過了蛋白質分子原有的電荷量，這就消除了不同蛋白質分子之間原有的 電荷差異，蛋白質 -SDS 復合物在溶液中的形狀像一個長橢圓棒。 SDS-PAGE 不僅可以分離 鑒定蛋白質，而且可以根據遷移率大小測定蛋白質亞基的分子量。DTT 和巰基乙醇相比，作用相似，但 DTT 的刺激性氣味要小很多，毒性也比巰基乙醇 低很多

11、。而且 DTT 比巰基乙醇的濃度低 7 倍時，兩者效果相近。但 DTT 價格略高一些。 DTT 有兩個巰基集團，巰基乙醇只有一個巰基集團。常用蛋白變性劑鹽酸胍和尿素尿素和鹽酸胍在高濃度 （48 mol/L） 水溶液時能斷裂氫鍵， 從而使蛋白質發生不同程度的 變性。 同事，還可以通過增大疏水基酸性殘基在水相中的溶解度， 降低疏水相互作用。 在室 溫下 46 mol/L 尿素和 34 mol/L 鹽酸胍，可使球狀蛋白質從天然狀態轉變至變性狀態的中 點，通常增加變性劑濃度可提高變性程度，通常 8 mol/L 尿素的變性能力強。一些球狀蛋白 質，甚至在 8 mol/L 尿素溶液中也不能完全變性，然而在

12、 8 mol/L 鹽酸胍溶液中，他們一般 以無規則卷曲 （完全變性 ） 構象狀態存在。尿素和鹽酸胍引起的變性包括兩種機制：1、變性蛋白質能與尿素和鹽酸胍優先結合，形成變性蛋白質-變性齊愎合物，當復合物被除去，從而引起Nt D反應平衡向右移動。隨著變性劑濃度的著呢國家， 天然狀態的蛋白質不斷轉變為復合物， 最終導致蛋白質完全變性。 然而， 由于變性齊與變性蛋白的結合是非常弱的。 因此， 只有高濃度的變性齊才能引起蛋白 質完全變性； 2、尿素與鹽酸胍對誰說氨基酸殘基的增溶作用。因為尿素和鹽酸胍都具有形 成氫鍵的能力， 當他們在高濃度時， 可以破壞水的氫鍵結構， 結果尿素和鹽酸胍就成為非極 性殘基的較