1、 流式分選的原理 流式分選的影響因素 分選流程及注意事項流式分選儀的原理及應用第1頁/共33頁流式細胞術（Flow Cytometry, 簡稱FCM）是一種可以快速、準確、客觀，并且能夠同時檢測直線流動狀態中的單個細胞的多項物理及生物學特性，加以分析定量的技術。流式細胞儀（Flow Cytometer）集激光技術、電子物理技術、光電測量技術、電子計算機技術、細胞熒光化學技術、單克隆抗體技術為一體的一種新型高科技儀器。流式細胞術第2頁/共33頁分析型流式細胞儀 VS 分選型流式細胞儀CaliburAriaIII第3頁/共33頁Catch tuber （捕獲管分選）唯一可選配分選裝置的小型機。第4

2、頁/共33頁電子偏轉的方式第5頁/共33頁 流式分選的原理 流式分選的影響因素 分選流程及注意事項流式分選儀的原理及應用第6頁/共33頁完美的分選純度純度得率得率速度速度第7頁/共33頁高速分選的影響因素 鞘液壓力（Pressure ) PSI 振蕩頻率 (Drop Frequency) Hz噴嘴大小 (Nozzle) m上樣速度(Sample Flow Rate ) events/sec 第8頁/共33頁分選最重要的問題 Good Purity 分選后所得到的細胞是否是想要的？ Good Recovery 分選后得到的細胞數量是否夠用? Good Viability 分選后有多少細胞是活的？

3、第9頁/共33頁Aria III 高純度 高得率 Sweet spot - 液滴斷點自動監控 Accudrop - 液滴延遲自動調節 32等分液滴分辨率，精確分選模式第10頁/共33頁Sweet Spot 液滴斷點自動監測 液滴斷點監測窗口 振幅自動調節，維持斷點穩定 阻塞報警，保護分選樣本不受 污染，實現分選時無人看管 提高分選純度和得率高得率分選,來自于液流穩定性第11頁/共33頁Accudrop 液滴延時自動控制 專利的BD Accudrop技術能夠自動地精確確定液滴延遲時間（細胞顆粒與激光正交的時間和細胞顆粒到達斷點處的時間這兩個時間的間隔）, 保證最高的分選純度及得率。 全部自動完成

4、精確計算，無需手動調節，并可實時監測。高純度分選,來自于精確地充電第12頁/共33頁Purity and sort coincidence Purity is also maintained by detecting sort coincidence第13頁/共33頁Aria III 液滴32等分分析高純度分選,來自于分析的精度Yield Mask第14頁/共33頁Tips: 如何提升分選的純度 設置合適的分選模式 選擇合適的噴嘴孔徑 確保穩定的液流斷點 設置正確的drop delay 進行4路分選時，將純度要求高的細胞分選設置在最外的2路 減少樣本的粘連 正確的設門 確保上樣管路清潔后回測第

5、15頁/共33頁Tips: 如何提升回收率 降低分選速度 減少純度要求 正確的drop delay 正確的加電 合適的收集管 保護細胞活力 正確的設門第16頁/共33頁Aria III 對細胞的保護 高活性 1. 無菌處理 Auto clean 2. 圓滑管路設計 3. NG流動池 低功率激光照射 4. 電子減速 5. 分選樣本溫控系統 （4、25、37、42）影響細胞活性的因素： 1. 細胞本身狀態 2. 細胞受到的撞擊 3. 激光照射 4. 細胞所處溫度影響 5. 系統潔凈程度第17頁/共33頁Tips: 如何提升活力 無菌環境的控制 降低鞘液壓力 增大噴嘴孔徑，脆弱細胞必須要用大孔徑噴嘴

6、 包被樣本收集管 溫度控制 提升速度第18頁/共33頁 流式分選的原理 流式分選的影響因素 分選流程及注意事項流式分選儀的原理及應用第19頁/共33頁鞘液 必須使用鹽離子緩沖溶液作為鞘液，通常是PBS，不建議使用生理鹽水 特別需要維持合適的pH值，通常為中性 無菌分選時，需要高壓滅菌鞘液（建議一直使用無菌鞘液） 一般不加NaN3 注意更換鞘液過濾器第20頁/共33頁合適樣本類型 細胞大小一般不超過噴嘴孔徑1/5，絕不能超過1/3 建議無菌樣本，容易維持上樣針部分的無菌條件 減少有高濃度PI的樣本，以免殘留在管路內，影響后續樣本活性 濃度可在107/ml 一定要使用300-400目孔徑過濾網過濾

7、第21頁/共33頁分選前 建議先進行預實驗，調整實驗設置，并且預估回收率，選擇合適的樣本量 Ficoll分離過的PBMC使用PBS+ 1% human AB serum 調整濃度到 12 x 107 PBMCs/mL第22頁/共33頁分選中 設門去除粘連體細胞 正確的分析 對于需要后續培養或是對于內毒素特別敏感的細胞，建議完成無菌分選準備流程 選擇合適的分選精度 選擇合適的噴嘴孔徑 選擇合適的上樣速度以保證純度和得率第23頁/共33頁第24頁/共33頁分選中 溫度的改變對細胞不利，控制上樣艙和收集的溫度 一些細胞需要特別的培養基或是血清來維持活性，加入不超過2%的血清 pH值的變化同樣會對細胞

8、活性有影響，加入不超過25 mM的HEPES到收集管中有助于維持pH 樣本的沉降容易導致速度的降低和細胞的聚集，導致堵塞，樣本分選前過濾，可使用混勻功能或上樣管過濾器，減少此類事件發生第25頁/共33頁收集 收集管預先用human AB serum包被，然后加入0.4 mL X-VIVO 15 培養液 + 10% human AB serum 及 0.2% acetylcysteine（用于培養），或是PBS + 1% Human AB serum（僅用于回測） 選擇合適的收集管，并調節分選液流加電，使得分選液流盡可能打在培養基、PBS、血清的液面上，而不是管壁 收集后的細胞，用250g,10

9、分鐘進行離心，小心取上清，用于后續實驗第26頁/共33頁提升活性 減少樣本收集前后的處理過程，去除不必要的離心和重懸 減少剪切力效應，輕柔使用移液槍 為減少細胞吸附到管壁，收集管使用聚丙烯材質，并用100% human AB serum包被 分選中可暫停，輕柔混勻樣本管和收集管，確保細胞懸浮第27頁/共33頁分選后 分選后回測需要確保前后條件一致，確認進樣針管路無殘留，回測樣本無酚紅 對于特別少的樣本，容易顯得雜質比較多 盡量將分選后細胞的洗滌過程減少到1次，并且休整數小時后再進行培養或是后續處理第28頁/共33頁分選后回測第29頁/共33頁1、開液流和高壓預熱30分2、定期更換鞘液濾器（一年一次）3、分選前檢查Nozzle和O-ring 4、及時清洗放置Nozzle的部位和Nozzle Locking Lever 5、檢查和更換快速接頭o-ring 6、使用PBS（不要使用生理鹽水），PBS要過濾（0.2um）儀器的維護保養第30頁/共33頁7、選擇合適的噴嘴和壓力8、液流啟動完，立刻用DI清洗Closed Nozzle ，定期超聲 清洗Clos