1、概念：概念：利用多種標記技術與免疫學技術相結利用多種標記技術與免疫學技術相結合而建立的分析技術體系。合而建立的分析技術體系。特點：高度特異性，高度靈敏性特點：高度特異性，高度靈敏性優(yōu)點：重復性好、準確性高、操作簡便、易優(yōu)點：重復性好、準確性高、操作簡便、易 于商品化和自動化。于商品化和自動化。分類：分類：固相測定，液體測定固相測定，液體測定按標記（示蹤）物分類：按標記（示蹤）物分類：化學發(fā)光免疫技術、金免疫技術等。化學發(fā)光免疫技術、金免疫技術等。 是是利用放射性核素可探利用放射性核素可探測的靈敏性、精確性測的靈敏性、精確性與抗原抗體反應的特與抗原抗體反應的特異性相結合而創(chuàng)建的異性相結合而創(chuàng)建的

2、免疫測定技術。免疫測定技術。同位素同位素一、放射性核素一、放射性核素射線：主要為射線：主要為131131I I、125125I I、5757CrCr和和6060CoCo；射線：主要有射線：主要有1414C C、3 3H H和和3232P P。放射性核素的選擇原則：放射性核素的選擇原則： （1）比活性（首要）。例如）比活性（首要）。例如125I比活性為比活性為1.74104Ci/g，14C比活性為比活性為4.5Ci/g，則，則1mol 125I或或14C結合到抗原上，結合到抗原上，125I的敏感度的敏感度約比約比14C大大3900倍。倍。 （2）合適的半衰期。）合適的半衰期。 （3）易于標記：低

3、能量的）易于標記：低能量的射線易于標記射線易于標記。 因而因而125I是目前常用的是目前常用的RIA標記物。標記物。三、標記物的制備及鑒定三、標記物的制備及鑒定1.標記方法：標記125I的方法可分兩大類，即直接標記法和間接標記法。 （1 1）直接標記法：）直接標記法：是將是將125125I I直接結合于蛋白質側鏈殘直接結合于蛋白質側鏈殘基的基的酪氨酸殘基或組氨酸殘基酪氨酸殘基或組氨酸殘基上。最常用的是氯胺上。最常用的是氯胺T T直接標記法。直接標記法。優(yōu)點：優(yōu)點：操作簡便；操作簡便；標記物具有高度比放射性。標記物具有高度比放射性。缺點：缺點：只能用于標記含酪氨酸或組氨酸的化合物；只能用于標記含

4、酪氨酸或組氨酸的化合物；含酪氨酸的殘基如具有蛋白質的特異性和生物活含酪氨酸的殘基如具有蛋白質的特異性和生物活性，則該活性易因標記而受損傷。性，則該活性易因標記而受損傷。優(yōu)點：優(yōu)點： 可標記缺乏酪氨酸或組氨酸的肽類及某些可標記缺乏酪氨酸或組氨酸的肽類及某些蛋白質；蛋白質；標記反應較為溫和，可以避免因蛋白標記反應較為溫和，可以避免因蛋白質直接加入質直接加入125125I I液引起的生物活性的喪失。液引起的生物活性的喪失。缺點：由于操作較復雜，標記蛋白質的比放射性顯缺點：由于操作較復雜，標記蛋白質的比放射性顯著低于直接法。著低于直接法。（2 2）間接標記法（又稱連接法）：）間接標記法（又稱連接法）：

5、是以是以125125I I標記在載體上，純化后再與蛋白質結合。標記在載體上，純化后再與蛋白質結合。（二）標記物的純化（二）標記物的純化1.1.凝膠過濾法（分子篩）凝膠過濾法（分子篩）2.2.離子交換層析法離子交換層析法3.PAGE3.PAGE4.4.高效液相色譜法（高效液相色譜法（HPLCHPLC）（三）標記物的鑒定 1.1.放射化學純度：放射化學純度：一般要求大于一般要求大于95952.2.比放射活性：比放射活性：指單位質量標記物中所含指單位質量標記物中所含的放射強度。用的放射強度。用mCi/mgmCi/mg（或（或mCi/mmolmCi/mmol）表示。表示。比度越高，測定越敏感。比度越高

6、，測定越敏感。3.3.免疫活性：免疫活性：B/TB/T在在8080以上，該值越大，以上，該值越大，表示抗原損傷越少。表示抗原損傷越少。19591959年年 YalowYalow和和BersonBerson創(chuàng)建，創(chuàng)建，19771977年年 YalowYalow獲諾貝爾獎金。獲諾貝爾獎金。第二節(jié)第二節(jié) 放射免疫分析放射免疫分析radioimmunoassay，RIA顯著特點：顯著特點：具有高度的敏感性（高達具有高度的敏感性（高達ngng甚至甚至pgpg水水平）平） 、特異性和精確性，特別適用于微量蛋白、特異性和精確性，特別適用于微量蛋白質、激素和多肽的定量測定。質、激素和多肽的定量測定。一、基本原

7、理一、基本原理 標記抗原（標記抗原（AgAg* *）和非標記抗原（）和非標記抗原（AgAg）對特異）對特異性抗體（性抗體（AbAb）的）的競爭競爭結合反應。結合反應。 放射免疫分析放射免疫分析是以核素標記的抗原與受檢是以核素標記的抗原與受檢標本中抗原標本中抗原競爭競爭特異性抗體來測定待檢樣品中特異性抗體來測定待檢樣品中抗原含量的方法。為經(jīng)典模式。抗原含量的方法。為經(jīng)典模式。 由于標記抗原與特異由于標記抗原與特異性抗體的量是固定的，性抗體的量是固定的，故標記免疫復合物的故標記免疫復合物的量就隨著待檢抗原的量就隨著待檢抗原的量而改變量而改變。 （二）實驗方法（二）實驗方法AgAg* *AgAgAb

8、Ab反應條件反應條件體積體積溫度溫度時間時間pHpH平衡法平衡法非平衡法非平衡法抗原抗體反應抗原抗體反應抗原抗體反應抗原抗體反應 如受檢標本抗原含量較高，抗血清的親和如受檢標本抗原含量較高，抗血清的親和常數(shù)較大，可選擇較高的溫度（常數(shù)較大，可選擇較高的溫度（15153737）進行較短時間的溫育，反之應在低溫（進行較短時間的溫育，反之應在低溫（44）作較長時間的溫育，形成的抗原抗體復合作較長時間的溫育，形成的抗原抗體復合物較為牢固。物較為牢固。 免疫復合物（免疫復合物（B B）與游離標記物（）與游離標記物（F F）的分離）的分離聚乙二醇沉淀法聚乙二醇沉淀法雙抗體法雙抗體法雙抗體雙抗體-PEG法法

9、 是一種將雙抗體與是一種將雙抗體與PEG二法相二法相結合的方法。此法保持了兩者結合的方法。此法保持了兩者的優(yōu)點，節(jié)省了兩者的用量，的優(yōu)點，節(jié)省了兩者的用量，而且分離快速、簡便。而且分離快速、簡便。晶體閃爍計數(shù)器晶體閃爍計數(shù)器包括了包括了NaINaI閃爍晶閃爍晶體、光電倍增管以體、光電倍增管以及計數(shù)器及計數(shù)器測量的放射性信測量的放射性信號是儀器輸出的號是儀器輸出的電脈沖數(shù)：每分鐘電脈沖數(shù)：每分鐘計數(shù)計數(shù)(cpm) (cpm) 計算計算 參數(shù)參數(shù)cpmcpmB/T (%)B/T (%)F/T (%)F/T (%)B/F (%)B/F (%)B/BB/B0 0 (%)(%)擬合擬合注：注：T T即是

10、即是B B與與F F的總和的總和標準曲線放射強度測定放射強度測定 數(shù)據(jù)處理數(shù)據(jù)處理 ICIC中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃中的放射性強度與受檢標本中抗原的濃度呈度呈反比反比。 Ag的量的量反應式反應式B/F值值04Ag*+0Ag+3Ab-3Ag*Ab+Ag*3/124Ag*+2Ag+3Ab-2Ag*Ab+1AgAb+2Ag*+1Ag2/284Ag*+8Ag+3Ab-1Ag*Ab+2AgAb+3Ag*+6Ag1/3免疫放射分析（免疫放射分析（immunoradiometricassay，IRMA）是用放射性核素標記的過量抗體是用放射性核素標記的過量抗體與待測抗原直接結合，采用固相免疫吸附載體

11、與待測抗原直接結合，采用固相免疫吸附載體分離結合與游離標記抗體的分離結合與游離標記抗體的非競爭非競爭放射免疫分放射免疫分析。析。第二節(jié)免疫放射分析第二節(jié)免疫放射分析Ag-Ag-* *AbAb復合物的放射性強度與待測抗原的量成正比關系復合物的放射性強度與待測抗原的量成正比關系（待測）（待測）（已知）（已知）一、基本原理一、基本原理 單位點單位點IRMAIRMA：（1 1）放射性核素標記的過量抗體）放射性核素標記的過量抗體+ +待測抗原，形成抗原抗體復合物；（待測抗原，形成抗原抗體復合物；（2 2）反應平衡）反應平衡后，采用固相抗原結合反應液中剩余的未結合標后，采用固相抗原結合反應液中剩余的未結合

12、標記抗體并將其分離；（記抗體并將其分離；（3 3）測定）測定上清液上清液的放射量。的放射量。雙位點雙位點IRMAIRMA：先用固相抗體跟抗原反應結合，然后先用固相抗體跟抗原反應結合，然后再用放射性核素標記的過量抗體與已結合于固相抗再用放射性核素標記的過量抗體與已結合于固相抗原的另一抗原決定蔟結合，形成原的另一抗原決定蔟結合，形成固相抗體固相抗體- -抗原抗原- -標標記抗體復合物（雙抗體夾心）記抗體復合物（雙抗體夾心），洗棄反應液中剩余，洗棄反應液中剩余的標記抗體，測定固相上的放射性。的標記抗體，測定固相上的放射性。 （待測）（待測）不論是單位點還是雙位點不論是單位點還是雙位點IRMAIRMA，最后測，最后測得的放射性與受檢抗原的量得的放射性與受檢抗原的量呈正比呈正比。四、IRMA與RIA比較應 用 常用于各種激素、微量蛋白質、腫瘤標志常用于各種激素、微量蛋白質、腫瘤標志物和藥物等物和藥物等微量物質微量物質的測定。的測定。 由于其具有放射污染和危害，常用核素半由于其具有放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長，以及具有不衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長，以及具有不易快速、靈活的自動化分析