1、yiT論女第表站家瓦氏黃顙魚(Pelteobagrus vachel)脂肪代謝相關基因cDNA的克隆及表達分析【摘要】：隨著水生動物營養學研究的不斷深入和完善，近年來,魚類的 脂類營養已逐漸成為營養學的一個研究熱點。迄今不同學者分別從脂類營養與動物的生長性能、生理學參數，以及生化酶和代謝之間的關系等方面做了大量的工作，但從分子水平上，尤其是有關外源營養素與 魚類代謝相關酶基因之間關系的研究仍頗為缺乏。本論文以瓦氏黃顙魚(darkbarbelcatfish,Pelteobagrusvachelli為研究對象,主要從分子角度 探討了脂肪種類、水平等對瓦氏黃顙魚幼魚生長和脂肪代謝的影響，研究結果可以

2、為完善瓦氏黃顙魚人工飼料配方和全價配合飼料的開 發提供參考。本論文利用分子生物學技術和生物信息學方法，首先克隆了瓦氏黃顙魚的主要脂肪代謝相關基因肝脂酶(hepaticlipase,HL),脂肪酸結 合蛋白(fattyacidbindingprotein,FABP),脂肪酸 合成酶 (fattyacidsy nthase,FAS) 和 肉 堿 酰 基 轉 運 酶 (carnitineacetyltransferase,CAT)的 cDNA 片段，分析了 這些基因 的 cDNA序列和分子特征，以及在不同組織中的表達模式。在此基礎上， 進行了室內飼養試驗，研究了飼料脂肪種類和水平等對瓦氏黃顙魚生 長

3、參數、脂肪代謝相關基因 mRNA表達的影響，探討了它們在機體脂 肪的分解、轉運，以及體內合成等過程發揮的作用。論文的主要結果 和結論如下：1瓦氏黃顙魚脂肪代謝相關基因的研究本研究根據GenBnak中提供的生物學信息設計簡并引物采用RT-PCR和克隆測序及生物信息學方法、從瓦氏黃顙魚肝臟中克隆得到肝脂酶，肝型脂肪酸結合蛋白，心型脂肪酸結合蛋白，脂肪酸合成酶和肉堿酰基轉運酶 基因的CDNA片段。肝脂酶是血液循環中內源性甘油三酯代謝的關鍵 酶之一。本試驗克隆了瓦氏黃顙魚肝脂酶的部分cDNA序列。該片段長為1065bp序列，軟件分析獲得了 343個氨基酸，其序列與斑馬魚 (Daniorerio)、日本

4、鰻鱺(Anguillajaponica)、鱖魚(Sinipercachuatsi) 斜 帶石斑魚(Epinepheluscoioides)真鯛(Pagrusmajor的肝脂酶具有很高 的同源性，分別為73%、68%、67%、66%和65%。經分析，所得瓦氏 黃顙魚肝脂酶氨基酸殘基中含有1個糖基化位點，催化中心三聯體位點1個和多肽蓋”等主要的結構功能位點，因而該基因屬于脂酶家族。 定量PCR分析表明肝脂酶只在肝臟組織中表達，表明瓦氏黃顙魚肝脂 酶的表達具有組織特異性，肝臟是分泌肝脂酶及其行使功能的主要場 所。脂肪酸結合蛋白是一類分子量較小，而對脂肪酸有高親和力的可 溶性蛋白質。本試驗采用簡并引物

5、擴增獲得了瓦氏黃顙魚脂肪酸結合 蛋白部分cDNA序列。肝型脂肪酸結合蛋白cDNA片段長為335bp, 軟件分析獲得111個氨基酸殘基，與鯉魚(Cyprinuscarpio)的肝型脂肪 酸結合蛋白的氨基酸序列同源性最咼，可達到90%。瓦氏黃顙魚心型 脂肪酸結合蛋白cDNA序列片段長為425bp序列，包括26bp3端非編 碼區。軟件分析后獲得114個氨基酸殘基，與斜齒鳊(Rutilusrutilus)的 心型脂肪酸結合蛋白氨基酸序列同源性高達85%。結果表明克隆所得基因序列均屬于脂肪酸結合蛋白家族。定量PCR分析表明,瓦氏黃顙魚肝型脂肪酸結合蛋白在肝臟、 腹腔脂肪、肌肉和心臟組織有較高的表達量。心

6、型脂肪酸結合蛋白主要在肝臟、脂肪組織和心臟中表達，表明肝臟和腹腔脂肪組織均是肝型和心型脂肪酸結合蛋白表達的主 要場所。脂肪酸合成酶能催化機體內脂肪酸的從頭合成住成內源性脂肪酸。本試驗采用RT-PCR技術成功分離了瓦氏黃顙魚脂肪酸合成 酶cDNA序列片段，序列長為674bp,軟件分析后獲得216個氨基酸殘 基與斑馬魚（D.rerio）脂肪酸合成酶氨基酸序列同源性最高（87%）,其次 是紅原雞 （Gallusgallus,79%）、 南方短尾負鼠 （Monodelphisdomestica,70%）褐家鼠（Rattusnorvegicus,68%等。定量 PCR分析表明，瓦氏黃顙魚脂肪酸合成酶 m

7、RNA在肝臟、腸道、腹腔 脂肪、心臟組織的表達水平顯著高于肌肉等組織（P0.05）,脂肪酸合成酶mRNA的表達量上升，有利于促進脂肪酸的生物合成，以滿足不同組 織細胞分化增殖對脂質營養和能量的需要。肉堿酰基轉運酶屬于轉運酶家族，能轉運從乙酰輔酶A到L-肉堿等酰基基團。本試驗獲得了瓦 氏黃顙魚肉堿酰基轉運酶部分 cDNA序列，片段長為494bp,序列軟件 分析后獲得156個氨基酸殘基，與斑馬魚（D.rerio）和紅原雞（Ggallus）的 肉堿酰基轉運酶氨基酸序列同源性分別為81%和70%,分析表明所得序列屬于酰基轉運酶家族。PCR檢測發現瓦氏黃顙魚肉堿酰基轉運酶 主要在肝臟、腹腔脂肪組織和肌肉

8、等組織中表達，提示這些組織均為能量代謝的重要場所。瓦氏黃顙魚肝脂酶、心型脂肪酸結合蛋白、脂 肪酸合成酶和肉堿酰基轉運酶 cDNA片段的成功克隆，為研究瓦氏黃 顙魚脂肪代謝提供了基礎資料。根據肝脂酶、心型脂肪酸結合蛋白、 脂肪酸合成酶和肉堿酰基轉運酶的組織表達特點，后續的生長試驗中,選擇了魚的肝臟和腹腔脂肪組織為目標靶器官，研究了飼料脂肪種類和水平對瓦氏黃顙魚的生長和脂肪代謝的影響。2飼料脂肪種類對瓦 氏黃顙魚的生長和脂肪代謝相關基因表達的影響研究了飼料中不同 脂肪種類對瓦氏黃顙魚幼魚生長、主要脂肪代謝相關基因表達的影 響。試驗以魚粉和豆粕為蛋白源，分別添加8%的全魚油、豆油、豬油、 混合油1(

9、豆油和魚油混合=3: 1)、混合油2(豆油和魚油混合=1: 3), 配制了等氮等能的5種飼料。每組設三重復，投喂初始平均體重約為 1.0g的幼魚80天。結果表明，魚油、豆油、混合油1和混合油2飼料 4個處理組均表現出較好的生長趨勢，終末體重和特定生長率分別達到 7.67g、7.47g、8.21g、8.31g 和 2.52%、2.50%、2.65%、2.63%,均 顯著高于豬油組6.13g和2.32%(P0.05)。飼料脂肪源對瓦氏黃顙魚的 腹腔脂肪率和肝體指數無顯著影響，腹腔脂肪率分別為 3.52%,4.49%,3.70%,3.92%,4.42% ；肝體指數分別為 2.66%,2.88%,3.

10、06%,3.08%,2.54%根據所得的結果，可以認為短期內 以豆油作為脂肪源不會顯著影響瓦氏黃顙魚的生長。定量PCR分析主要脂肪代謝相關基因mRNA表達顯示,在肝臟組織中，混合油2組的 脂蛋白脂酶，肝脂酶，肝型脂肪酸結合蛋白和肉堿酰基轉運酶 mRNA表 達量均顯著高于其它組(P0.05)。而豬油組能促進脂肪酸合成酶mRNA 表達上調，且顯著高于其它組(P0.05)。同時，在腹腔脂肪組織中，脂蛋白 脂酶和肝型脂肪酸結合蛋白 mRNA表達具有組織特異性，各組間均無 顯著差異。混合油1組脂肪酸合成酶表達顯著高于魚油組(P0.05),而 其它組間無顯著差異。肉堿酰基轉運酶mRNA的表達在混合油1和混

11、合油2組中表現為上調,且顯著高于豬油組(P0.05)。混合油2組飼 料中多不飽和脂肪酸百分含量(46%)最高能促進肝臟脂蛋白脂酶、肝 脂酶、肝型脂肪酸結合蛋白和肉堿酰基轉運酶mRNA的表達顯著上調(P0.05),提高飼料多不飽和脂肪酸的利用率，從而促進了瓦氏黃顙魚 幼魚的生長。上述結果提示，不同的飼料脂肪種類主要通過調節瓦氏 黃顙魚肝臟的脂蛋白脂酶和肝脂酶分解脂蛋白的能力，使得肝型脂肪 酸結合蛋白轉運脂肪酸、脂肪酸的合成活動發生相應的變化，最終使機體生長和代謝所需的脂肪酸得到滿足。3脂肪水平對瓦氏黃顙魚幼 魚的生長和脂肪代謝相關基因表達的影響探討了飼料中不同脂肪水 平對瓦氏黃顙魚幼魚生長和主要

12、脂肪代謝相關基因表達的影響。以魚粉和脫脂豆粕為飼料蛋白源，魚油和大豆油等比例混合為脂肪源，分別 配制含有5%,11%和20%三個脂肪水平的等氮飼料。試驗組每組各設 三個重復，投喂初始平均體重1.0g左右的幼魚,70天后5%、11%和20% 處理組平均體重分別為8.45g、7.92g、6.94g。經統計分析,5%和 11% 處理組的終末體重、特定生長率顯著高于20%處理組。從生長試驗來 看,飼料脂肪水平對瓦氏黃顙魚的生長有顯著的影響，隨著飼料脂肪水平增加，腹腔脂肪率顯著升高(P0.05)分別是2.56%,4.27%和 6.06%；但 隨飼料脂肪水平提高，魚的肝體指數沒有顯著變化，分別為2.59%

13、； 2.47%和 2.58%。對主要脂肪代謝相關基因 mRNA的定量PCR分析 顯示,隨著飼料脂肪水平的升高，肝臟脂蛋白脂酶，肝脂酶和肝型脂肪 酸結合蛋白的mRNA表達水平顯著提高(P0.05);而脂肪酸合成酶和 肉堿酰基轉運酶的mRNA表達水平卻顯著下降(P0.05),肉堿酰基轉運ww 論女第表匸涼酶mRNA表達在11%處理組和20%處理組之間無顯著差異（P0.05）。 同時，在腹腔脂肪組織中，11%處理組脂蛋白脂酶基因 mRNA的表達量 顯著低于20%處理組（P0.05）,略低于5%處理組。肝型脂肪酸結合蛋白 mRNA表達在11%處理組中最低，并顯著低于5%處理組（P0.05）。肉堿 酰基

14、準轉運酶mRNA表達在20%處理組最高，顯著高于11%處理組和 5%處理組（P0.05）。此夕卜,5%處理組脂肪酸合成酶表達水平顯著高于 11%處理組和20%處理組（P0.05）。上述研究結果表明，飼料脂肪水平會 影響肝臟和腹腔脂肪組織脂肪代謝相關基因mRNA的表達；過高的飼料脂肪水平，能通過增強肝臟和腹腔脂肪組織中的脂肪分解，促進脂 肪酸轉運,抑制脂肪酸生成等環節來調節脂肪的代謝，以減少脂肪在機 體內組織器官的沉積。4瘦素對瓦氏黃顙魚脂肪代謝相關基因表達的 影響本試驗分析了腹腔注射小鼠瘦素重組蛋白對瓦氏黃顙魚肝臟脂 肪代謝的影響。試驗設置4個處理組，分別注射20卩g/100卩1,5卩g/10

15、0卩I, 磷酸緩沖液（PBS,100和未注射空白組（對照組），每個組含三個重復， 每個重復放養9尾試驗魚（體重30±0.5g）。對試驗魚隔天注射一次，連 續飼養15天，按常規飼養投喂和管理。試驗結果表明，與未注射組的魚 相比,注射不同含量的瘦素均能顯著地提高魚肝臟中肉堿酰基轉運酶 mRNA的表達量（P0.05）,但不同注射劑量的各瘦素處理組間無顯著性 差異。低瘦素濃度組能顯著地促進肝型脂肪酸結合蛋白mRNA的表達（P0.05）但注射瘦素會顯著抑制脂肪酸合成酶 mRNA的表達，且隨注 射濃度的增加，其mRNA的表達隨之明顯下降（P0.05）。此外，瘦素注射 能增加脂蛋白脂酶和肝脂酶mR

16、NA的表達,但均與對照組無顯著差異(P0.05)。結果提示外源瘦素可能是通過促進肝型脂肪酸結合蛋白 mRNA的表達，增加了體內脂肪酸的轉運能力；同時，由于脂肪酸合成 酶mRNA表達水平的降低，抑制了體內脂肪酸的合成，從而促進機體脂 肪代謝活動，維持魚體的脂肪貯存量和能量的平衡。【關鍵詞】：瓦氏黃顙魚飼料脂肪豆油脂蛋白脂酶肝脂酶脂肪酸結合蛋白脂肪酸合成 酶肉堿酰基轉運酶瘦素【學位授予單位】：華東師范大學【學位級別】：博士【學位授予年份】：2010【分類號】：S917.4【目錄】：摘要6-11Abstract11-16第一章文獻綜述16-39第一節魚類 脂肪代謝的研究進展16-23第二節脂肪代謝相關基因的研究現狀23-37第三節本論文研究的目的和意義 37-39第二章瓦氏黃顙魚脂肪 代謝相關基因的研究39-80第一節瓦氏黃顙魚HL基因cDNA序列的 克隆及分析39-52第二節瓦氏黃顙魚FAS基因cDNA序列的克隆及 分析52-60第三節瓦氏黃顙魚 FABP基因cDNA序列的克隆及分析 60-72第四節瓦氏黃顙魚CAT基因cDNA序列的克隆及分析72-80第 三章飼料脂肪種類對瓦氏黃顙魚幼魚生長和脂肪代謝相關基