1、一株海洋瓊膠酶產生菌的分離、篩選和初步鑒定劉美英，梅建鳳，應國清*,王鴻(浙江工業大學藥學院，浙江杭州310014)摘要：目的從海水中分離活性較高的瓊膠卿產牛菌，以制備瓊膠卿用于瓊膠寡糖的牛產， 瓊膠寡糖具有多種牛物活性，在食品、化妝、醫藥等行業有廣闊的應用前景。方法 以瓊膠 為唯一碳源，用稀釋涂布平板法進行分離，平板透明圈法進行初篩，搖瓶培養法進行復篩， 改進的dns比色法進行酶活力的測定。結果 從海水屮分離篩選到18株瓊膠降解菌株，經 復篩得到一株產酶活力較髙的海洋細菌hs0326-601,并對該菌株進行了初步鑒定，結果表 明其為革蘭氏陰性細菌，菌體呈短桿狀。結論鑒于該菌株生長速度快，通過

2、對其進一步的 誘變和發酵條件優化，有與成為高產瓊膠酶產生菌，從而為瓊膠酚、瓊膠寡糖的深入研究和 開發應用奠定基礎。關鍵詞：瓊膠降解菌；瓊膠酶；分離；篩選中國分類號： 文獻標識碼：a文章編號：0000-0000(2008)00-0000-00isolation, screening and identification of agarase-producing bacteria from the seawaterliu mei-ying, mei jian-feng, ying guo-qing*, wang hong (college of pharmaceutical science, zh

3、ejiang uni versity of technology, hangzhou 310014, ch ina)abstract: objective to degrade agar into agaro-oligosaccharide by the agarase with a higher activity, the strains were separated from seawater. the agaro-oligosaccharide have shown wide application values in food industry, cosmetic industry,

4、pharmaceutical industry and other sectors methods the agarasc-pnxlucing baccria were isolated by the spread plate method, firsl-scrccning by clear halos on agar plate containing agar as the solc-carbon source, second-screening of shaking culture. the enzymatic activities were determined by improved

5、dns colorimetry method results 18 agar-degrading strains were isolated from the seawater, and a more powerful agarase-producing marine bacterium was obtained the strain was designated as strain hs0326-601 and identified preliminarily as gram negative, rod-shaped. conclusion 基金項目：浙江省科技計劃項h (2007c3306

6、8)作者簡介：劉美英，女，碩士研究生水通訊作者：應國消，男，教授，碩士生導師tel: (0571) 88871029 e-mail: gqyingwith regard to its high growth speed, if further treated with mutagens, the strain might be one with a high enzymic activity after fermentation optimization, and it could be used to the further study and applied to the preparat

7、ion of agarase for agaro-oligosaccharide production in industry.key words: agarase-producing bacteria; agarase; isolation; screening瓊膠(agar)是一種從海洋紅藻中提取得到的多糖，其在食品、醫藥衛生等 行業已有悠久的應用歷史，但由于瓊膠黏度高，水溶性低，不易被吸收，因此在 應用方面受到很大的限制。而瓊膠寡糖(agarooligosaccharide),即瓊膠多糖經 水解后聚合度為210的低聚糖，又稱瓊膠低聚糖，主要出瓊二糖的重復單位連 接而成，水溶性好，有利于人

8、體吸收，人人提高了其應用價值，瓊膠寡糖具有較 強的抗癌山習、抗氧化84】、抗炎25】及抗病毒山6等活性，是一種極具開發潛力的 低聚糖。瓊膠酶能降解瓊膠生成瓊膠寡糖，與瓊膠的化學降解相比，瓊膠酶降解 瓊膠則具有特異性強的優點，可選擇性地酶解切斷特定化學鍵，從而制得特定聚 合度的寡聚糖，并且具有反應條件溫和，降解過程易于控制，無副反應，環境污 染少等優點，在制備瓊膠寡糖屮具有明顯的優勢。除了制備瓊膠寡糖之外，瓊膠 酶還可用作工具晦、用于冋收dna或rna、海藻多糖結構的研究等叫 我國 對于海藻多糖降解酶的研究尚處于起步狀態，進行的研究大多局限于產酶菌株的 篩選、酶的制備、純化與性質分析、及酶的應用

9、等方面，還未見關于其投入規模 化發酵生產的報道，關鍵就在于缺乏酶活力高的菌株。因此篩選高產瓊膠酶產 生菌具有重要的理論意義和應用價值。目前，瓊膠酶產生菌可以從海水、海洋動 物腸道、底泥等海洋環境以及湖泊、河流、排污口等陸地環境屮獲得山心，甚 至從菠菜根系屮也可篩選到瓊膠降解菌株u叫但大多數瓊膠酶產生菌從海洋環境 中分離得到山。本實驗先后從舟山、臺州等地采集海水樣，從小分離篩選到一株 活力較高的菌株，并對其進行了初步鑒定。旨在為瓊膠酶、瓊膠寡糖的深入研究 和開發應用提供基礎。1材料與方法1.1材料1.1.1海水樣品取口浙江舟山冊子島、金塘和朱家尖等藻類繁殖地和臺州溫嶺箸 橫、塢沙門及三門等紫菜養

10、殖地海水。1丄2培養基組成%1 分離培養基(): nacl 2.5； nh4c1 0.1； mgso4*7h2o 0.5； kc1 0.1；feso4*7h2o 0.002； cacl2 0.02； nah2po4 0.06；瓊脂 2； ph 7.0。%1 斜面培養基（）: nacl 2.5；酵母浸出粉0.5；mgso47h2。0.5； kc1 0.1； feso4-7h2o 0.002； cacl2 0.02； nah2po4 0.06；葡萄糖 0；瓊脂 2； ph 7.0o%1 復篩培養基（）:堀旨0.2；酵母浸出粉0.25；其他成分同海水分離培養 基。以上培養基均為121 °c

11、、20 min滅菌；液體培養基裝量為35 ml/250 ml搖瓶。1.2方法1.2.1海水樣品的采集采集海水樣品裝于贈料瓶屮，紫菜等樣品裝于樣品袋屮。采集的樣品置于4°c 冰箱保存。1.2.2樣品的馴化富集取瓊膠適量，海水樣品40 ml,在酒精燈旁加入250 ml錐形瓶屮，28 °c、 200 r-min1連續振蕩培養，定期加入適量蒸粥水至原體積，h測培養液明顯混濁 后，取培養液4ml接種于含瓊膠5g、36 ml該海水樣品的三角瓶中，垂復上述 培養過程。1.2.3菌株的分離采用稀釋涂布平板法：用無菌移液管吸収海水或富集樣品5 ml,加入含一 層玻璃珠和45 ml無菌人工海水

12、的三角瓶中，200 rimin'1振蕩30 min,混勻制成 菌懸液，用無菌人工海水適當稀釋，移取0.2 ml涂布于分離培養基平板上，28 °c 培養，直至平板上長出菌落。1.2.4菌株的初篩觀察平板上菌落形態，挑取周帀形成明顯凹陷的菌落，并在平皿底部作標記, 再滴加盧戈氏碘液染色。保留那些平板上能產生透明圈菌落的對應斜面，棄去染 色后無透明圈菌落的對應斜面，將前者置于28 °c培養，供復篩用。1.2.5菌株的復篩用接種環挑収初篩菌株的新鮮斜面菌苔2環，接入復篩搖瓶培養基中,28 °c、 200 r*min_1發酵培養48 h。將發酵液于3000 rimi

13、n'1下離心10 min后取上清液測 酶活力，篩選出產酶活力最高的菌株進行純化。1.2.6菌種純化用接種環挑取復篩得到的新鮮斜而種菌苔，用無菌人工海水適當稀釋，取0.2 ml涂布于分離培養基平板上。28 °c培養，直至平板上長出菌落，將單菌落 挑至斜面上培養。然后進行復篩，方法同124,篩選出產酶活力最高的菌株用 于發酵產酶。1.2.7瓊膠酶活力的測定%1 粗酶液的制備 將發酵液于3000 r-min1下離心10 min后上清液即為粗酶液。%1 改進的dns比色法測定瓊膠酶活力 用ph 7.0的na2hpo4nah2pcu緩沖液 配制0.2 %的瓊膠底物溶液20 mlo加入4

14、 ml待測酶液，35 °c、150 r-min1搖床 反應1 ho立即取1 ml反應液于帶有刻度的試管中，丿j口入0.5o1ldns溶液于沸 水浴中共熱5 min后立即冷卻至室溫，定容至10 mlo測520 nm波長處的吸光 度。%1 酶活力單位定義在上述反應條件下，1 ml酶液1 min產生1 pg還原糖為一 個酶活(u)o1.2.8菌體濃度的測定 采用紫外可見分光光度法在620 nm波長下測定培養液 的吸光度。1.2.9菌株的初步鑒定瓊膠降解菌株的初步鑒定按參照文獻14進行。首先觀察菌落形態、鏡檢觀 察個體形態，革蘭氏染色，再作進一步鑒定。2結果與分析2.1瓊膠降解菌株的篩選2.

15、1.1菌株的初篩在對舟山、臺州各地的海水樣進行早期篩選后發現，溫嶺箸橫紫菜養殖地的 海水樣屮的瓊膠酶產生菌校多，且產酶活力也較高。故在本研究小對該海水樣進 行馴化富集，以瓊膠為唯一碳源進行富集培養，以期獲得更多、酶活力更高的瓊 膠降解菌株。平板培養后用盧戈氏碘液染色，瓊膠與碘結合而被染色。產瓊膠酶 的菌株，由于其菌落周i韋i瓊膠被降解形成瓊膠寡糖，而瓊膠寡糖具有還原性，不 能著色，因此其菌落周圍可形成透明圈，這樣便可以很好地從海水樣中分離篩選 到瓊膠降解菌。觀察培養基平板可發現菌落所在的培養基呈釜底形凹陷，并且有 較大的透明圈，篩選的平板透明圈見圖lo采用此法，分離到了 18株瓊膠降解 菌，分

16、別測定其菌落直徑和透明圈直徑，結果見表1。圖1瓊膠酶篩選平板經盧戈氏碘液染色后的照片fig. 1 photograph of the agar plate stained by lugofs for agarolytic strains screening表1 18株瓊膠降解菌菌落直徑和透明圈直徑tab. 1 diameter of colony and halo from 18 strainsstrainsdiameter ofcolonies (de) /cmdiameter of inner clear halos (dh ) /cmhc value (dh /de)10.2140.43

17、82.04720.2300.4662.02630.2020.4282.11940.1620.3602.22250.1860.3902.09760.5241.0181.94370.1200.3042.53380.2400.4842.01790.2160.3981.843100.1980.4122.081110.1000.2862.860120.0540.2083.852130.1180.2462.085140.2140.5362.505150.1880.4882.596160.8302.0162.429170.2000.4522.260180.2100.5102.429由表1可以看出，6、14、

18、16號菌株所產的透明圈較大，但由于即使同一個 平皿上長出的菌落，其人小也不一，細胞生物量也有所不同，透明圈的人小并不 能反映菌株產酶的比活性，因此分別測定它們的菌落直徑，但發現這18株菌株 的hc值（dh/dc）也相差不大。為了客觀地反映菌體的生長和產酶能力，將此 18株菌株進行進一步的篩選。2.1.2菌株的復篩利用平板初篩只能定性地挑選出產酶菌株，而以搖瓶培養形式進行的復篩則可以定量地比較各菌株產晦活力及其菌體生長情況。復篩培養基仍以瓊膠作為唯 一碳源，培養48 h后分別測定發酵液的瓊膠晦活力和菌體濃度。結果見表2。表2復篩各菌株產酶活力的比較tab. 2 comparision of ag

19、arase activity produced by different strainsstrainsenzyme activity /uconcentration of strains(od620)19.381.96424.251.08639.201.61245.090.81354.430.719612.091.19075.091.44483.591.46994.900.618105.461.572116.020.807123.870.693135.091.134144.811.534156.580.7621611.250.285175.271.012186.581.639由表2可見，6和1

20、6號菌株的晦活較高，分別為12.09 u和11.25 u,選前 者作為高產菌株，編號為hs0326-6o在此值得一提的是，16號菌株的透明圈直 徑為2.016 cm,其hc值為2.429 cm,而6號菌株透明圈和hc值各為1.018cm 和1.943 cm?？梢?6號菌株的透明圈和hc值均比6號大，|佃前者的酶活卻不 如后者，其他菌株的情況也與此類似，這就說明在評價菌株產酶活性高低時，應 以搖瓶復篩數據為準，而初篩屮透明圈和hc值的大小僅作參考。這與湯海青 指出的“透明圈的大小與菌株產酶活性的高低有一定正相關''并不一致。關于透明 圈和酗活之間的關系，有待進一步研究。2.1.3

21、菌種純化從口然環境中的微生物樣品，經過一次分離形成單菌落，轉接斜面培養得到 的菌株，因脫離了口然環境條件，在傳代培養中細胞發生性狀衰退的頻率增加， 直接使用往往存在酶活急劇下降，甚至喪失酶活，需要經過多次純化培養才能達 到穩定的遺傳。實驗對復篩得到的高產瓊膠降解菌株hs0326-6進行試管斜面活 化和平板再次純化，以篩選出產酶活力較高且穩定的菌株。經過純化培養，得到 高產菌株hs0326-601,其酶活為20.78 u,較純化前提高了 72 %,且酶活穩定。 2.2菌株hs0326-601的初步鑒定菌株hs0326-601在分離培養基平板上培養，34d天可以形成菌落，菌落大 小中等。菌落形態特

22、征為：菌落呈圓形，淡黃色，邊緣整齊，表面濕潤，中央凹 陷，不透明（圖2）。斜面培養21 h左右菌苔鋪滿斜面，菌苔呈淡黃色，厚度屮 等（圖3）。鏡檢觀察菌株的個體形態和革蘭氏染色結果表明，菌株hs0326-601 為革蘭氏陰性細菌，菌體呈短桿狀，見圖4。圖2瓊膠降解菌的平板純化圖fig. 2 clones of agarolytic bacteria in plate cultivation圖3瓊膠降解菌的斜面培養fig. 3 tube culture of agarolytic bacteria圖4顯微鏡觀察的菌體（放人1000倍）fig> 4 the shape of strain o

23、bserved by microscopy （x 1000）3討論3.1在對紫菜養殖地的海水樣、紫菜樣及土樣進行早期篩選后發現，海水樣屮篩 選到的瓊膠降解菌株較多，口產酶活力明顯高于后兩者。故本實驗對海水樣進行 馴化富集，以期獲得更多、產酶活力更高的瓊膠降解菌株。3,2本實驗中發現，透明圈和hc值均較大的菌株，其酶活不一定較高，說明在 評價菌株產酶活性高低時，我們應以搖瓶復篩數據為準，而初篩中透明圈和hc 值的大小僅作參考。3.3菌株hs0326-601在分離培養基平板上生長較慢，一般需要34 d左右才能 長成大小適宜的單菌落。而斜面培養時生長則較快，培養21 h左右即可長出較 厚的菌苔。鑒于

24、該菌株生長速度快，通過對其進一步的誘變和發酵條件優化，有 望成為高產瓊膠酶產生菌，從而為瓊膠酶、瓊膠寡糖的深入研究和開發應用奠定 基礎。此外，實驗中還發現此類菌株對環境變化較為敏感，遺傳性能不夠穩定， 多次傳代后產酶活力有所下降。因此，在后續實驗屮，除了對菌種進行保藏之外， 還需對菌株進行定期活化。目前正在對此菌株進行進一步的鑒定，同時，為提高 其產酶活力，對該菌株的誘變選育和發酵條件優化也正在進行之中。references1 wang j x , mou h j , jiang x l . biological activities of a neutral water-soluble ag

25、ar polysaccharide prepared by agarase degradation j. high tech lett. 2005, 11(4): 415-420.21 enoki t , sagawa h , tominaga t , et al. drugs, foods or drinks with the use of algac-dcrivcd physiologically active substances: us, 6475990p 2002-11-05.3 xue c h , xu q , zhao x , et al. radical scavenging

26、ability of agar oligomerj. j fish chin (水產學報),2003, 27(3): 283-288.4 chen h m , yan x j , zhu p , et al. antioxidant activity and hepatoprotective potential of agaro-oligosaccharides in vitro and in vivoj/ol. nutrition journal, 2006,5:31 2006-12-02 http:/www.nutritionj.eom/content/5/1/31. wang q j ,

27、 chen y , zhu w y . the immune effect of functional oligosaccharides on animal organism j. cereal feed ind (糧食與飼料工業),2000, (6): 35-36.6 mazumder s , ghosal p k , pujol c a ,刃 al. isolation, chemical investigation and antiviral activity of polysaccharides from gracilaria corticata (gracilariaceae, rh

28、odophyta) j. int j biol macromol, 2002, 31: 87.7 li n z , qiu r r , peng y y. advances in agarasej. life sci res (生命科學研究),2006, 10(2): 62-66. liu j t , cai j p , wu b progress of studies on agarase and its applications. mod food sci technol (現代食品科技),2005,21(1): 177-179.9 tang h q . studys on the breeding of agarase