1、羊肚菌液體菌種培養技術初探摘要:近年來，我國已進行了羊肚菌培養的研究，但通常是采用固體培養法，對其菌絲球液體培養的研究尚不多見。為此，我們進行了羊肚菌液體菌種培養基配方的研究，以期為羊肚菌菌種的生產提供新的途徑。以常規無菌操作技術，將玉米粒大小的菌塊接入已滅菌的待用液體培養基中，于24靜置24h后移至搖床培養箱內震蕩培養。對羊肚菌菌絲體液體培養條件的研究表明：當溫度為25，搖床轉速為100rmin，三角瓶裝量為100mL，培養液pH為7.0，可以明顯地提高菌絲體的生物量；對羊肚菌進行液體搖瓶培養，以菌絲生物量、菌絲球的大小及個數為篩選指標，通過單因素方差分析，確定了羊肚菌菌絲體生長的最佳液體培

2、養基配方為：馬鈴薯200g，KH2PO4 2g，MgSO4 0.6g，VB1 0.5mg，葡萄糖20g，乳酸 3g，酵母膏 1g，水1000mL，pH 7.0。關鍵詞:羊肚菌；搖瓶培養；液體培養基 The technique exploration to cultivating the liquid culture of MorchellaconicaAbstract: In recent years, China has launched a culture of Morchella conica, but they are usually in solid culture, liquid

3、culture mycelium of their research is still rare. So in order to provide for the production of new strains of Morchella conica basis, we have had a research about a morel liquid formulation of cultured bacteria, By aseptic technique, put a size of the corn fungus block access into the stand-steriliz

4、ed liquid medium, and after standing 24h at 24 in shaking shaking move. On liquid culture of Mycelium research shows that: When the temperature is 25 , rotation speed is 100r/min, flask volume of 100mL, pH 7.0 medium, which can significantly increase the biomass of mycelium.culture the Morchella con

5、ica in liquid shake flask again, choosing by the mycelial biomass, pellet size and the number of indicators, and analysis single factor of variance, we can determine the optimal growth of Mycelium in liquid medium, and the composition: potatoes 200g, KH2PO4 2g, MgSO4 0.6g, VB1 0.5mg, glucose 20g, la

6、ctic acid 3g, yeast extract 1g, water 1000mL, pH 7.0.Keywords: Morchella conica; Flask culture; Liquid medium羊肚菌(Morchella conica) 又名美味羊肚菌，俗稱羊雀菌、包谷菌等，隸屬子囊菌亞門( Ascomycotina) 、盤菌綱( Discomycetes) 、盤菌目( Pezizales) 、羊肚菌科( Morchellaceae) 、羊肚菌屬( Morchella) 。據報道，全球羊肚菌屬共有30 多個種，分布于亞洲、歐洲、北美洲及大洋洲的一些地區，所以羊肚菌的分布

7、是世界性的。羊肚菌多分布在公路邊、河邊、山坡、峽谷、火燒林、闊葉林或針闊混交林的腐殖質層土上。生長的土壤類型有黑壤土、山地灰褐森林土、沙壤土、黃壤土等6。羊肚菌子實體的生長季節在每年的3 5 月和89 月, 氣溫達10 20 , 地表溫度達12 24 , 月降雨量一般35 60 mm2-3。所以, 羊肚菌是在低溫、高濕條件下萌發子實體的1。羊肚菌的菌絲體呈白色, 有分隔, 分隔處有縊縮, 隔膜上有孔洞, 多核, 無鎖狀聯合, 異宗接合, 常產生菌核( 一種堅硬的、無性細胞團, 是羊肚菌的營養貯藏器官, 在休眠階段可使其渡過不良的氣候條件)，尚未發現有分生孢子或其他無性孢子出現14。羊肚菌子實體

8、的菌蓋近球形或圓錐形, 邊緣全部與柄相連, 表面起伏成蜂窩狀網棱紋, 因其形狀像羊肚而被稱為羊肚菌。菌柄內部空心, 外面平整或有凹槽，顏色從灰白到深褐色15-17。子囊呈圓柱形, 每個子囊含8 個子囊孢子, 單行排列子囊之間有長的側絲, 子囊孢子呈卵圓形2,7-9。羊肚菌是一種珍稀的野生食用菌，也是一種高級營養滋補品。羊肚菌在國際市場上供不應求，價格一直居高不下。早在6070年代，歐美各國就通過發酵生產菌絲體作為調味品投放市場11。近年來，細胞外代謝產物的研究11-12，發酵制品提高免疫功能及抗腫瘤功能的研究4，是液體培養成為一個重要的研究方向。本實驗從羊肚菌的液體培養條件和培養基著手，篩選出

9、最佳液體培養條件和最優搖瓶培養基，目的是能夠進一步有效的研究和開發利用這一珍貴的真菌資源。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 菌種及來源羊肚菌(Morchella conica)，試管母種購于華中農大微生物實驗室。1.1.2 儀器及型號北京產電子天平 BS2202S，自動電熱蒸汽滅菌器 LDZX-40AZ,凈化工作臺 SW-CJ-LFD，上海產電熱恒溫鼓風干燥箱DHG-9070A，HNY-恒溫培養振蕩器等。1.1.3 培養基配方一：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 2g，MgSO4 0.6g，VB1 0.5mg，酵母膏1g，乳酸3g，水1000mL，pH 7.0。配方二：葡萄糖20

10、g，KNO3 2g，KH2PO4 0.5g，MgSO4 0.5g，NaCl 0.5g，水1000mL，pH 7.0。配方三：馬鈴薯200g，蔗糖20g，KH2PO4 1g，MgSO4 0.5g，蛋白胨2g，酵母膏 1g，水1000mL，pH 7.0。配方四：馬鈴薯200g，葡萄糖50g，KH2PO4 3g，MgSO4 1.5g，VB1 10mg，水1000mL，pH 7.0。配方五：玉米粉20g，蛋白胨1g，葡萄糖20g，K2HPO4 1g，MgSO4 0.5g，水1000mL，pH 7.0。配方六：胡蘿卜200g，黃豆粉20g，蔗糖20g，K2HPO4 1g，MgSO4 1g，VB1 1mg

11、，水1000mL，pH 7.0。PDA液體培養基配方：馬鈴薯200g，蔗糖15g，水1000mL, pH自然。1.2實驗方法1.2.1 培養基制備按以上七種配方分別制備培養基，配方中有馬鈴薯者，將馬鈴薯去皮切塊（0.5´1cm）稱重，置沸水中煮25min，用四層紗布過濾擠壓取其汁液置于燒杯中，同時加入其他藥品攪拌使其充分溶解，加水定容至1000mL，測定并調整酸堿度，將制備好的培養基分別裝入250mL三角瓶中，封口，在1.14´1.05Pa的壓強120下高壓滅菌30min后，待高壓鍋中的氣壓降至0，取出三角瓶冷卻后置于無菌接種箱中備用19。1.2.2 液體培養條件的篩選在2

12、50mL三角瓶中，按常規無菌操作技術分別裝入80、90、100、110、120mL容量的PDA培養基；分別加入玻璃珠5、10、15、20、25粒；分別將pH調至6、6.5、7、7.5、8的條件下分3組進行試驗，按常規無菌操作技術每瓶接入等量3個玉米粒大小試管母種于菌液中靜置24 h,然后移至振蕩培養箱中,在 25 、100 r/min振蕩培養至終點菌絲為止。1.2.3 搖瓶培養基的篩選在液體培養條件的篩選基礎上，在250mL三角瓶中，每配方分別裝入100mL培養基、10粒玻璃珠，pH用NaOH或HCl溶液調至7.0，按常規無菌操作技術每瓶接入等量3個玉米粒大小試管母種于菌液中靜置24 h,然后

13、移至振蕩培養箱中,在 25 、100 r/min振蕩培養至終點菌絲為止。1.3 測定指標與方法1.3.1 菌絲生物量的測定取出搖瓶終點菌絲（菌球表面出現粗糙、有絮狀時），去掉接種進去的菌塊，過濾后用無菌水沖洗3次。60烘干稱重，重復3次取其平均值。1.3.2 菌絲球數量的測定將上述各配方液體培養基菌懸液震蕩搖勻，分別取10mL靜置后數菌球數，重復三次，取其平均值。1.3.3 菌絲球直徑測定將六種配方菌液搖勻，分別取10mL倒入培養皿中，靜置后，皿底墊坐標紙，將菌球用解剖針撥動排成直線，量取直線長度，算出菌球直徑。2 實驗結果及分析2.1 羊肚菌液體培養條件2.1.1 培養基容量對菌絲生長的影響

14、實驗結果表明(圖一)：培養基容量在100mL以下，隨著培養基容量的增加，生物量也增加。裝入100mL培養基時，生物量為1.10g。但裝得過多，生物量不會成比例增加。裝入120mL培養基，生物量僅為0.99g。比裝100m L培養基時下降10。以100mL/250mL三角瓶為最適宜，生物量最高。2.1.2 玻璃珠數量對菌絲生長量的影響文獻報道7，添加不同數量的玻璃珠可以提高某些擔子菌的生物量，并能改變菌絲球的大小。但是本實驗結果未能說明各處理存在明顯的差異。2.1.3 酸堿度對菌絲生長的影響實驗結果表明(圖二)，pH 7.0時，生物量為0.96g；pH 8.0時，生物量為0.65g。pH 6.0

15、時，生物量為0.53g。在pH6.57.5范圍內，菌絲生長較好，生物量比較高。pH超過7.5或者低于6.5，生物量下降，因此，最適pH為7.0。2.2 搖瓶培養基的篩選2.2.1羊肚菌在六種配方的搖瓶培養基上的生物量表1羊肚菌在六種配方的搖瓶培養基上的生物量（g/100mL）重復配方A1A2A3A4A5A610.8720.0030.0110.1380.7850.20120.9310.0080.0480.4150.6410.98131.3200.0150.0210.3170.5760.67541.3030.0310.0250.3220.7320.55951.0250.0180.0330.2570

16、.7280.480總和5.4510.0750.1381.4493.4622.896T6=13.471平均數1.0900.0150.0280.2892.4250.5792.693表2 羊肚菌在六種配方的搖瓶培養基上的生物量的方差分析配方平均數（Xi）差異顯著性Xi-0.015Xi-0.028Xi-0.289Xi-0.579Xi-0.692A1A5A6A4A3A21.0900.6920.5790.2890.0280.0151.075*0.677*0.564*0.274*0.0131.062*0.664*0.551*0.261*0.801*0.403*0.290*0.511*0.1130.398*L

17、SD0.05=2.064´0.098=0.202 LSD0.01=2.797´0.098=0.274*表示差異極顯著，*表示差異顯著羊肚菌在六種配方的搖瓶培養基上的生物量的測定結果見表1，從表1中可以看出羊肚菌在配方一的搖瓶培養基上的生物量最大。對其進行方差分析，結果見表2。檢驗結果表明：羊肚菌在不同的搖瓶培養基上的生物量各不相同，在配方一的培養基上生物量達到最大，為1.09g，與配方二、三、四、五、六培養基上的生物量達到極顯著差異。配方二、三的培養基上的生物量最小，其差異不顯著。2.2.2 不同培養基配方菌絲球數量及大小結果見表3。培養基配方菌絲球個數（個/100mL）菌

18、絲球大小（mm）4915-18128-171610-251810-253113-162313-15實驗結果表明，六種培養基都可形成菌絲球，但菌絲球大小及個數不均一，培養基形成的菌絲球較大，直徑分別為1518mm、1316mm和1315mm。六種培養基的菌絲球個數以培養基的較多，其中培養基的最多，菌絲球數量為49個/100mL。綜合上述，羊肚菌液體菌種最佳培養基為配方一，其組成為：馬鈴薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 2g，MgSO4 0.6g，VB1 0.5mg，酵母膏1g，乳酸3g，水1000mL ，pH7.0。培養后菌絲球個數最多，為49個/100 mL，菌絲球大小為1518mm，生

19、物量為1.090g/100mL。3 討論羊肚菌是一種珍稀食藥用真菌，營養豐富，含有多種抗病毒、抗腫瘤等作用的生理活性物質，在食品、保健品、醫藥化妝品等領域有著廣闊的應用前景。在20世紀60年代，美法等國家利用羊肚菌菌絲體制造出調味品13,18；日本利用其菌絲體提取黑色素抑制劑，開發了具有美白效果的化妝品；我國在開發羊肚菌保健方面有較大進展。本實驗進行了羊肚菌液體培養最優配方和生長條件的篩選，對羊肚菌開發應用具有重要的意義，有關羊肚菌液體菌種培養所需營養物質還需進一步深入研究20。參考文獻：1 李樹森, 陳文強, 鄧百萬等. 秦巴山區羊肚菌種類和生境調查初報J. 食用菌學報.2007, 14(1

20、): 30.2 任桂梅, 張少剛. 羊肚菌的研究進展J. 延安大學學報: 自然科學版, 1999, 18（1）: 5764.3 謝占玲, 謝占青. 羊肚菌研究綜述J. 青海大學學報: 自然科學版, 2007，25（2）: 3640.4 賈健全等. 羊肚菌發酵制品保健機理初探, 食用菌, 1996, 18（4）: 4041.5 范貴增等. 液體發酵生產食用菌菌絲體條件研究. 食品與發酵, 1993, （1）: 4350.6 談峰, 胡加如, 汪凱華. 羊肚菌野生生態條件調查研究J. 食用菌, 1996, （6）: 2.7 董愛榮, 吳慶禹, 何力等. 羊肚菌的生物學特征J. 東北農業大學學報, 2002, 30（4）: 2830.8 金若忠. 羊肚菌研究進展綜述J. 林業科學通訊, 1997, （4）: 2124.9 李華, 包海鷹, 李丕. 羊肚菌研究進展J. 菌物研究, 2004, 2（4）: 5360.10 李春喜, 邵云, 姜麗娜. 生物