1、第三章第三章 細(xì)胞生物學(xué)研究方法細(xì)胞生物學(xué)研究方法一、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察一、細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)觀察 一光學(xué)顯微鏡一光學(xué)顯微鏡 普通光鏡的性能指標(biāo)：放大率（放大倍普通光鏡的性能指標(biāo)：放大率（放大倍數(shù)），分辨力，清晰度、焦點深度，鏡象亮度數(shù)），分辨力，清晰度、焦點深度，鏡象亮度 分辨力分辨力（分辨率、分辨本領(lǐng)）：能分辨兩個（分辨率、分辨本領(lǐng)）：能分辨兩個物點之間最短距離的能力，通常是以分辨距離物點之間最短距離的能力，通常是以分辨距離來表示的，即分辨距離越小，則分辨力越高。來表示的，即分辨距離越小，則分辨力越高。 人肉眼分辨力測試，是規(guī)定在明視距離為人肉眼分辨力測試，是規(guī)定在明視距離為25cm25cm所分辨

2、的最短間距來表示，正常人肉眼分辨力的所分辨的最短間距來表示，正常人肉眼分辨力的極限值是極限值是0.1 mm0.1 mm毫米。顯微鏡的分辨力可按下毫米。顯微鏡的分辨力可按下列公式來計算列公式來計算 : : r=0.61 r=0.61 / na / na （r r是分辨距離，是分辨距離，0.610.61是常數(shù)，是常數(shù)， 是照明光波波長，是照明光波波長，nana是顯微鏡物鏡的是顯微鏡物鏡的鏡口率鏡口率光學(xué)性能指標(biāo)，光學(xué)性能指標(biāo)，每個物鏡的外殼上都標(biāo)有其鏡口率的數(shù)值）。每個物鏡的外殼上都標(biāo)有其鏡口率的數(shù)值）。 分辨距離分辨距離r r與鏡口率與鏡口率nana成反比關(guān)系成反比關(guān)系 若把最大鏡口率若把最大鏡

3、口率1.25（ 即油鏡鏡口即油鏡鏡口率）代入公式，可見，率）代入公式，可見， 最小分辨距離最小分辨距離 。 由于可見光中最短波長（紫光）由于可見光中最短波長（紫光）0.4m0.4m（即（即400nm400nm），）， 普通光鏡最大分辨普通光鏡最大分辨力的理論極限應(yīng)為力的理論極限應(yīng)為0.2m0.2m。 請記請記 住住 0.2 0.2 ! ! 這個數(shù)值就是顯微這個數(shù)值就是顯微 水平與亞（超）微水平的分界線。水平與亞（超）微水平的分界線。 顯微鏡的分辨力有一定的極限，顯微鏡的分辨力有一定的極限， 其放大率受分辨力制約而不可能無限其放大率受分辨力制約而不可能無限提高。提高。 普通光鏡放大率的普通光鏡放

4、大率的經(jīng)驗界值經(jīng)驗界值：有效放大倍數(shù)極限有效放大倍數(shù)極限 物鏡最大鏡口率物鏡最大鏡口率10001000 例：例： 普通顯微鏡的油鏡鏡口率為普通顯微鏡的油鏡鏡口率為1.251.25，故此臺顯微鏡的，故此臺顯微鏡的最大有效最大有效放大倍放大倍數(shù)為數(shù)為12501250倍。倍。 高級研究顯微鏡的油鏡鏡口率為高級研究顯微鏡的油鏡鏡口率為1.41.4，則此鏡的則此鏡的最大有效最大有效放大倍數(shù)為放大倍數(shù)為14001400倍。倍。 如果放大倍數(shù)超過限度，如果放大倍數(shù)超過限度， 則視野中物象則視野中物象會變模糊會變模糊 ，細(xì)微結(jié)構(gòu)反倒分辨不清，細(xì)微結(jié)構(gòu)反倒分辨不清 ，成，成為了為了 無效放大無效放大。 由于物鏡

5、鏡口率受由于物鏡鏡口率受入射入射鏡口角鏡口角和和介質(zhì)折射率介質(zhì)折射率的限制，的限制， 不可能再不可能再更進(jìn)一步提高了。更進(jìn)一步提高了。 所以科學(xué)家們從另外所以科學(xué)家們從另外兩個途徑來改進(jìn)顯微鏡：兩個途徑來改進(jìn)顯微鏡： i i. .換用短波長的換用短波長的“照明光源照明光源”，來提高分，來提高分辨力。如：辨力。如： 紫外光顯微鏡、電子顯微鏡紫外光顯微鏡、電子顯微鏡 ii ii. .應(yīng)用特殊光學(xué)效應(yīng)應(yīng)用特殊光學(xué)效應(yīng)， 增強反差，增強反差， 來提來提高分辨能力。高分辨能力。 如：相差顯微鏡、微分干如：相差顯微鏡、微分干涉顯微鏡涉顯微鏡 相差顯微鏡相差顯微鏡 phase contrast micros

6、copephase contrast microscope 原理：光波的三個光學(xué)特性：（原理：光波的三個光學(xué)特性：（1 1）光波有）光波有波波長長。 對于光波波長變化，肉眼覺察為顏色變化對于光波波長變化，肉眼覺察為顏色變化; ;（2 2）光波有）光波有振幅振幅。 對于光波振幅變化（即振幅對于光波振幅變化（即振幅差），肉眼覺察為明暗變化；差），肉眼覺察為明暗變化； （3 3）光波有）光波有相位相位（ 相位是指某一時刻，相位是指某一時刻， 光在其前進(jìn)路線上的位光在其前進(jìn)路線上的位置）。對于光相位的變化（即相位差），肉眼是置）。對于光相位的變化（即相位差），肉眼是不能覺察的。不能覺察的。 當(dāng)光線穿過

7、無色透明且非勻質(zhì)的被檢物體（如當(dāng)光線穿過無色透明且非勻質(zhì)的被檢物體（如活細(xì)胞），其波長和振幅都無明顯變化，僅光相活細(xì)胞），其波長和振幅都無明顯變化，僅光相位出現(xiàn)了一定程度的變化，此時觀察會感覺反差位出現(xiàn)了一定程度的變化，此時觀察會感覺反差較小，對物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)難分辨，這就是較小，對物體內(nèi)部的結(jié)構(gòu)難分辨，這就是普通光普通光鏡不適宜用于觀察活細(xì)胞的原因。鏡不適宜用于觀察活細(xì)胞的原因。 相差顯微鏡卻是運用一些特殊裝置，使通相差顯微鏡卻是運用一些特殊裝置，使通過被檢物體的光線分離成兩組光波，并人過被檢物體的光線分離成兩組光波，并人為地促使這兩組光波之間微弱的相位差加為地促使這兩組光波之間微弱的相位差加

8、大，再經(jīng)過大，再經(jīng)過光波干涉光波干涉作用，使看不見的相作用，使看不見的相位差轉(zhuǎn)變成可見的振幅差，從而造成反差位差轉(zhuǎn)變成可見的振幅差，從而造成反差增強，便能夠清晰看到被檢物體及其內(nèi)部增強，便能夠清晰看到被檢物體及其內(nèi)部細(xì)微結(jié)構(gòu)了。所以，細(xì)微結(jié)構(gòu)了。所以，相差顯微鏡下的樣品相差顯微鏡下的樣品標(biāo)本不需染色，即可以十分清晰地觀察活標(biāo)本不需染色，即可以十分清晰地觀察活細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化細(xì)胞及其內(nèi)部結(jié)構(gòu)的變化。 特點：特點： 相差顯微鏡的觀察效果是被檢物相差顯微鏡的觀察效果是被檢物體比其周圍背景略暗，而物體外圍顯現(xiàn)有體比其周圍背景略暗，而物體外圍顯現(xiàn)有一圈明亮的光環(huán)。一圈明亮的光環(huán)。倒置顯微鏡倒置顯微

9、鏡則是將相差顯微鏡的構(gòu)則是將相差顯微鏡的構(gòu)件顛倒裝配，本末倒置而成的，并件顛倒裝配，本末倒置而成的，并裝有恒溫設(shè)備、閉路電視和縮時攝裝有恒溫設(shè)備、閉路電視和縮時攝象機，是能夠完善適用于象機，是能夠完善適用于細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)的觀察監(jiān)視系統(tǒng)。的觀察監(jiān)視系統(tǒng)。微分干涉顯微鏡微分干涉顯微鏡卻是另一種不需染卻是另一種不需染色而可以直接觀察色而可以直接觀察活細(xì)胞活細(xì)胞精細(xì)結(jié)構(gòu)精細(xì)結(jié)構(gòu)及動態(tài)變化的技術(shù)設(shè)備，其分辨率及動態(tài)變化的技術(shù)設(shè)備，其分辨率比普通光鏡要提高一個數(shù)量級。比普通光鏡要提高一個數(shù)量級。3.熒光顯微鏡 fluorescence microscope 原理：以紫外光為光源，使被檢材料中原理：以紫外

10、光為光源，使被檢材料中的熒光物質(zhì)激發(fā)出熒光，從而對細(xì)胞內(nèi)的熒光物質(zhì)激發(fā)出熒光，從而對細(xì)胞內(nèi)某些物質(zhì)進(jìn)行定性和定位分析。熒光現(xiàn)某些物質(zhì)進(jìn)行定性和定位分析。熒光現(xiàn)象有兩種：象有兩種：1.1.自發(fā)熒光自發(fā)熒光細(xì)胞內(nèi)某些天細(xì)胞內(nèi)某些天然熒光物質(zhì)被紫外光照射所然熒光物質(zhì)被紫外光照射所 激激 發(fā)發(fā) 的的 熒熒光，光， 例，葉綠素例，葉綠素血紅色自發(fā)熒光；血紅色自發(fā)熒光；2.2.誘發(fā)熒光誘發(fā)熒光在細(xì)胞中加入某種不會使在細(xì)胞中加入某種不會使細(xì)胞化學(xué)組分變性的熒光染料（細(xì)胞化學(xué)組分變性的熒光染料（ 熒光熒光素素 ），）， 與細(xì)胞內(nèi)某種特定成分結(jié)合在與細(xì)胞內(nèi)某種特定成分結(jié)合在一起，經(jīng)紫外光照射激發(fā)出熒光。一起，經(jīng)

11、紫外光照射激發(fā)出熒光。例：熒光染料例：熒光染料吖啶橙吖啶橙，可使，可使rnarna發(fā)發(fā)出紅色熒光，而使出紅色熒光，而使dnadna發(fā)出綠色熒發(fā)出綠色熒光。光。結(jié)構(gòu)特點：結(jié)構(gòu)特點：1 1 采用紫外光發(fā)生裝置：采用紫外光發(fā)生裝置： 高壓汞燈高壓汞燈 + + 激發(fā)裝置激發(fā)裝置 + + 濾光裝置濾光裝置 2 2 透鏡由石英玻璃制成，透鏡由石英玻璃制成，以便減少光通路上的紫外光損耗以便減少光通路上的紫外光損耗 3 3 目鏡中要裝目鏡中要裝壓紫濾片壓紫濾片 熒光顯微鏡目前在分子細(xì)胞生物學(xué)研究中應(yīng)用熒光顯微鏡目前在分子細(xì)胞生物學(xué)研究中應(yīng)用十分廣泛，以熒光素標(biāo)記各種探針進(jìn)行基因定十分廣泛，以熒光素標(biāo)記各種探針

12、進(jìn)行基因定位分析或?qū)δ承┨囟ǖ鞍踪|(zhì)進(jìn)行定性定位檢測位分析或?qū)δ承┨囟ǖ鞍踪|(zhì)進(jìn)行定性定位檢測分析，靈敏清晰。在熒光顯微鏡下對樣品可同分析，靈敏清晰。在熒光顯微鏡下對樣品可同時采用兩種以上熒光探針檢測，依據(jù)其不同顏時采用兩種以上熒光探針檢測，依據(jù)其不同顏色的熒光信號，我們能一次判斷識別多個基因色的熒光信號，我們能一次判斷識別多個基因（或蛋白）的位點，因此這是非常實用的研究（或蛋白）的位點，因此這是非常實用的研究技術(shù)。例如，綠色熒光蛋白技術(shù)。例如，綠色熒光蛋白 gfpgfp 可用于進(jìn)行可用于進(jìn)行活體觀察。活體觀察。 此外，此外， 由于在熒光標(biāo)記檢測實驗由于在熒光標(biāo)記檢測實驗中，中， 易發(fā)生一些非檢測

13、目標(biāo)出現(xiàn)假象的易發(fā)生一些非檢測目標(biāo)出現(xiàn)假象的 “ “背背景噪音景噪音” ” 問題，問題， 因而現(xiàn)可在熒光顯微鏡設(shè)備因而現(xiàn)可在熒光顯微鏡設(shè)備上安裝一套上安裝一套“數(shù)字成像處理系統(tǒng)數(shù)字成像處理系統(tǒng)”，即把圖像，即把圖像信息通過攝像機和電腦的圖象數(shù)字化處理，使信息通過攝像機和電腦的圖象數(shù)字化處理，使信號反差得以放大增強，對假象削弱或消除，信號反差得以放大增強，對假象削弱或消除，從而明顯提高檢測的準(zhǔn)確率和靈敏度。從而明顯提高檢測的準(zhǔn)確率和靈敏度。激光掃描共焦顯微鏡laser scanning confocal microscope 激光掃描共焦顯微鏡激光掃描共焦顯微鏡的物鏡和聚光鏡是的物鏡和聚光鏡是聚

14、焦于同一焦點之上，故能排除焦平面聚焦于同一焦點之上，故能排除焦平面以外熒光的干擾，因此其分辨率比普通以外熒光的干擾，因此其分辨率比普通熒光顯微鏡要提高熒光顯微鏡要提高1.41.41.71.7倍，倍， 并還能并還能 以以“光學(xué)切片光學(xué)切片”方式去觀察較厚樣品之方式去觀察較厚樣品之中的內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)。中的內(nèi)部精細(xì)結(jié)構(gòu)。 （二）電子顯微鏡（二）電子顯微鏡 1.1.透射電鏡透射電鏡 transmission electron microscope ,transmission electron microscope , temtem 透射電鏡的成像光路圖，與光鏡的基本類似。透射電鏡的成像光路圖，與光鏡的基

15、本類似。只不過是以電子槍所發(fā)射的高速電子流代替了只不過是以電子槍所發(fā)射的高速電子流代替了照明光源，又以三組電磁線圈所構(gòu)成的磁透鏡照明光源，又以三組電磁線圈所構(gòu)成的磁透鏡代替了玻璃制成的聚光鏡、物鏡和目鏡。代替了玻璃制成的聚光鏡、物鏡和目鏡。 第第一組磁透鏡能將電子流聚集到樣品上一組磁透鏡能將電子流聚集到樣品上 （ 故稱故稱為會聚鏡），第二組磁透鏡能使穿透過樣品的為會聚鏡），第二組磁透鏡能使穿透過樣品的電子射線折射形成初級放大象（稱為物鏡），電子射線折射形成初級放大象（稱為物鏡），而第三組磁透鏡則是通過第一、第二中間鏡和而第三組磁透鏡則是通過第一、第二中間鏡和投影鏡進(jìn)行連續(xù)三次的再放大，最終投射

16、到熒投影鏡進(jìn)行連續(xù)三次的再放大，最終投射到熒光屏上，使電子圖象轉(zhuǎn)變成可見的光學(xué)圖象。光屏上，使電子圖象轉(zhuǎn)變成可見的光學(xué)圖象。 特點：特點： （1 1）照明光源不同照明光源不同； （2 2）放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同放大倍數(shù)的調(diào)節(jié)方式不同。 是依靠改變是依靠改變磁透鏡的激磁電流強度來調(diào)節(jié)放大倍數(shù)的。也磁透鏡的激磁電流強度來調(diào)節(jié)放大倍數(shù)的。也就是說，電流強度的變化引起了磁場強度的改就是說，電流強度的變化引起了磁場強度的改變，而磁場強度的變化又使電子射線的折射程變，而磁場強度的變化又使電子射線的折射程度發(fā)生改變，因而放大倍數(shù)即隨之出現(xiàn)變化。度發(fā)生改變，因而放大倍數(shù)即隨之出現(xiàn)變化。 （3 3）具有高壓穩(wěn)壓

17、系統(tǒng)具有高壓穩(wěn)壓系統(tǒng)。 電子流的發(fā)射速度電子流的發(fā)射速度及波長皆取決于電壓的高低，通常透射電鏡的及波長皆取決于電壓的高低，通常透射電鏡的電壓達(dá)幾萬電壓達(dá)幾萬十幾萬伏的高壓。十幾萬伏的高壓。（4 4 ）有高度真空的工作系統(tǒng)有高度真空的工作系統(tǒng)。因為高速運。因為高速運動的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞動的電子流如果與空氣中的微粒和分子碰撞就會改變它的發(fā)射方向，導(dǎo)致成像模糊。故就會改變它的發(fā)射方向，導(dǎo)致成像模糊。故要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必要求電鏡內(nèi)的工作系統(tǒng)（包括樣品室）都必須保持高度真空狀態(tài)，須保持高度真空狀態(tài)， 并且樣品都必須脫并且樣品都必須脫水。因此說，水。因此說，透射電鏡不

18、能用來觀察活的樣透射電鏡不能用來觀察活的樣品品。（5 5）樣品厚度必須樣品厚度必須 900 3nm - - nm-m nm-m3nm - - nm-m nm-m成象機制成象機制 簡單簡單 簡單簡單 復(fù)雜復(fù)雜 復(fù)雜復(fù)雜 一般一般 簡單簡單 nuclear magnetic resonance nuclear magnetic resonance 核磁共振核磁共振 atomic force microscope atomic force microscope 原子力顯微鏡原子力顯微鏡二、細(xì)胞生化分析二、細(xì)胞生化分析 （一）組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色法（一）組織化學(xué)和細(xì)胞化學(xué)染色法histochemic

19、al and cytochemicalhistochemical and cytochemical staining methods staining methods 利用某種顯色劑能與某種細(xì)胞成分特異利用某種顯色劑能與某種細(xì)胞成分特異性相結(jié)合，顯示特定顏色的原理，對組性相結(jié)合，顯示特定顏色的原理，對組織和細(xì)胞內(nèi)某些成分進(jìn)行定位和定性分織和細(xì)胞內(nèi)某些成分進(jìn)行定位和定性分析的研究方法。可對無機鹽、蛋白質(zhì)、析的研究方法。可對無機鹽、蛋白質(zhì)、醛類、碳水化合物、脂類、核酸和酶類醛類、碳水化合物、脂類、核酸和酶類等多種成分檢測鑒定。等多種成分檢測鑒定。 例：例：孚爾根反應(yīng)孚爾根反應(yīng)（feulgenfeu

20、lgen） 特定顯示特定顯示dnadna的細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。的細(xì)胞化學(xué)技術(shù)。 其原理是，其原理是， 經(jīng)稀鹽酸經(jīng)稀鹽酸水解打開水解打開dnadna上嘌呤堿與脫氧核糖之間的連接上嘌呤堿與脫氧核糖之間的連接鍵，暴露出醛基，由于自由醛基能與無色品紅鍵，暴露出醛基，由于自由醛基能與無色品紅（希夫試劑）反應(yīng)形成紫紅色的化合物，據(jù)此（希夫試劑）反應(yīng)形成紫紅色的化合物，據(jù)此可對細(xì)胞內(nèi)的可對細(xì)胞內(nèi)的dnadna進(jìn)行進(jìn)行定性定性和和定位定位檢測。檢測。 此此外，由于其染色的深度與外，由于其染色的深度與dnadna濃度是成正比關(guān)濃度是成正比關(guān)系，所以當(dāng)孚爾根法染色后，再用顯微分光度系，所以當(dāng)孚爾根法染色后，再用顯微分光

21、度計測量，即可對細(xì)胞內(nèi)的計測量，即可對細(xì)胞內(nèi)的dnadna含量進(jìn)行含量進(jìn)行定量定量測測定。定。 再例：再例：comoricomori法法顯示酸性磷酸酶：顯示酸性磷酸酶： 磷酸脂磷酸脂 磷酸根磷酸根 磷酸鉛磷酸鉛 硫化鉛硫化鉛（棕黑色）（棕黑色）酶解ph5.0鉛鹽硫化銨（二）免疫細(xì)胞化學(xué)（二）免疫細(xì)胞化學(xué)immunocytochemistryimmunocytochemistry 依據(jù)抗體能與對應(yīng)的抗原自行相互識別結(jié)依據(jù)抗體能與對應(yīng)的抗原自行相互識別結(jié)合的免疫學(xué)原理，來檢測特定蛋白質(zhì)在細(xì)合的免疫學(xué)原理，來檢測特定蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的分布狀況。首先將某種抗體聯(lián)結(jié)上胞內(nèi)的分布狀況。首先將某種抗體聯(lián)結(jié)上標(biāo)

22、記物（光鏡觀察用的標(biāo)記物是標(biāo)記物（光鏡觀察用的標(biāo)記物是熒光素?zé)晒馑鼗蚧蛎该福欢婄R觀察用的標(biāo)記物是；而電鏡觀察用的標(biāo)記物是膠體金膠體金），），再與組織或細(xì)胞樣品混合反應(yīng)，隨后在光再與組織或細(xì)胞樣品混合反應(yīng)，隨后在光鏡或者電鏡下檢查標(biāo)記物沉積的部位，即鏡或者電鏡下檢查標(biāo)記物沉積的部位，即對對抗原抗原進(jìn)行定位測定。如果標(biāo)記物是熒光進(jìn)行定位測定。如果標(biāo)記物是熒光素，則是在熒光顯微鏡下檢查熒光信號部素，則是在熒光顯微鏡下檢查熒光信號部位，以顯示抗原所存在的位置。位，以顯示抗原所存在的位置。 抗體與抗原結(jié)合的方式分抗體與抗原結(jié)合的方式分直接法直接法和和間接法間接法兩種，兩種，直接法是先制備抗血清，直接法

23、是先制備抗血清， 將抗體與熒光素結(jié)合，將抗體與熒光素結(jié)合，然后再用其浸染樣品，待熒光抗體與抗原結(jié)合反然后再用其浸染樣品，待熒光抗體與抗原結(jié)合反應(yīng)后，再在熒光顯微鏡下鑒別抗原的存在部位。應(yīng)后，再在熒光顯微鏡下鑒別抗原的存在部位。而間接法的不同之處是在抗原抗體初級反應(yīng)的而間接法的不同之處是在抗原抗體初級反應(yīng)的基礎(chǔ)上，再增加一種能同初級抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)基礎(chǔ)上，再增加一種能同初級抗體發(fā)生結(jié)合反應(yīng)的次級抗體（即的次級抗體（即“抗抗體抗抗體”），從而使初級反應(yīng)），從而使初級反應(yīng)效果得到效果得到“放大放大”，以增強分析觀察的靈敏性和，以增強分析觀察的靈敏性和準(zhǔn)確性。如果與抗體聯(lián)結(jié)的標(biāo)記物是酶，則可采準(zhǔn)確性。

24、如果與抗體聯(lián)結(jié)的標(biāo)記物是酶，則可采用與酶的底物反應(yīng)，用與酶的底物反應(yīng)， 產(chǎn)生呈某種顏色的沉積物，產(chǎn)生呈某種顏色的沉積物，再依據(jù)這種特定顏色沉積物的出現(xiàn)位置，來對再依據(jù)這種特定顏色沉積物的出現(xiàn)位置，來對探探測物質(zhì)測物質(zhì)的定性定位分析，這被稱為的定性定位分析，這被稱為酶標(biāo)抗體酶標(biāo)抗體法。法。 例如，例如， 辣根過氧化物酶辣根過氧化物酶 是常被用作標(biāo)記物的是常被用作標(biāo)記物的酶，酶， 該酶可催化過氧化氫與該酶可催化過氧化氫與二氨基聯(lián)苯胺二氨基聯(lián)苯胺 發(fā)生發(fā)生氧化反應(yīng)，形成棕色的沉積物，從而便于在光鏡氧化反應(yīng)，形成棕色的沉積物，從而便于在光鏡或電鏡下進(jìn)行觀察分析。或電鏡下進(jìn)行觀察分析。( (三三) )顯

25、微分光光度測定技術(shù)顯微分光光度測定技術(shù)microspectrophotometrymicrospectrophotometry 細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分對光的吸收均有專一的波細(xì)胞內(nèi)各種化學(xué)成分對光的吸收均有專一的波段，段， 例如核酸是吸收紫外光例如核酸是吸收紫外光260nm260nm光波，氨基光波，氨基酸則吸收酸則吸收280nm280nm光波。光波。 此外，有些細(xì)胞成分經(jīng)此外，有些細(xì)胞成分經(jīng)過細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)處理后，也對可見光波有特過細(xì)胞化學(xué)染色技術(shù)處理后，也對可見光波有特定的吸收光譜。依據(jù)這種特性，運用顯微分光光定的吸收光譜。依據(jù)這種特性，運用顯微分光光度計可對某些細(xì)胞成分進(jìn)行度計可對某些細(xì)胞成分

26、進(jìn)行定位定位和和定量定量分析。目分析。目前，最先進(jìn)的顯微光譜分析儀器是前，最先進(jìn)的顯微光譜分析儀器是流式細(xì)胞儀流式細(xì)胞儀，它是采用激光作為光譜測量光源，還采用了細(xì)胞它是采用激光作為光譜測量光源，還采用了細(xì)胞流動系統(tǒng)和電腦數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所以，一秒鐘可流動系統(tǒng)和電腦數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)，所以，一秒鐘可測定測定50005000個細(xì)胞的多種參數(shù)，例如個細(xì)胞的多種參數(shù)，例如 dnadna含量、含量、蛋白質(zhì)含量、蛋白質(zhì)含量、 細(xì)胞體積和直徑等等細(xì)胞體積和直徑等等, , 此外還可將此外還可將含不同成分的細(xì)胞迅速大量分離。含不同成分的細(xì)胞迅速大量分離。（四）顯微放射自顯影（四）顯微放射自顯影microradiogra

27、phymicroradiography 依據(jù)照相原理，利用放射性同位素所發(fā)射出來的依據(jù)照相原理，利用放射性同位素所發(fā)射出來的射線射線 （主要是（主要是 粒子），粒子）， 使感光材料（照相乳使感光材料（照相乳膠）上產(chǎn)生潛影（此過程稱為膠）上產(chǎn)生潛影（此過程稱為“曝光曝光”，即讓照，即讓照相乳膠上的溴化銀還原成銀），再經(jīng)過顯影和定相乳膠上的溴化銀還原成銀），再經(jīng)過顯影和定影，即可觀察到用同位素標(biāo)記的某種物質(zhì)在標(biāo)本影，即可觀察到用同位素標(biāo)記的某種物質(zhì)在標(biāo)本中的位置和數(shù)量。中的位置和數(shù)量。 常用的放射性同位素有常用的放射性同位素有 3 3h h、1414cc、3232p p和和3535s s等。等。例

28、如：例如： 用用3 3h h標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷可測定標(biāo)記的胸腺嘧啶核苷可測定dnadna的的合成代謝；用合成代謝；用3 3h h標(biāo)記的尿嘧啶核苷可研究標(biāo)記的尿嘧啶核苷可研究rnarna的的合成代謝，合成代謝， 用用1414cc或或3535s s標(biāo)記可研究蛋白質(zhì)的合標(biāo)記可研究蛋白質(zhì)的合成。由于此技術(shù)靈敏度很高，是對生物大分子進(jìn)成。由于此技術(shù)靈敏度很高，是對生物大分子進(jìn)行精細(xì)定位的有效方法。行精細(xì)定位的有效方法。 其操作過程：其操作過程：（1 1）同位素標(biāo)記實驗樣品；）同位素標(biāo)記實驗樣品；（2 2）樣品標(biāo)本制備（包括固定、包埋、切片或）樣品標(biāo)本制備（包括固定、包埋、切片或 超薄切片或滴片）；超薄切

29、片或滴片）；（3 3）涂布乳膠（在暗室）；）涂布乳膠（在暗室）； （4 4）曝光（自顯影，在暗盒內(nèi)）；）曝光（自顯影，在暗盒內(nèi)）；（5 5）顯影、定影、清洗；）顯影、定影、清洗；（6 6）標(biāo)本染色；）標(biāo)本染色； （7 7）在光鏡下或電鏡下觀察。）在光鏡下或電鏡下觀察。 由于放射性同位素標(biāo)記對人不安全，且由于放射性同位素標(biāo)記對人不安全，且有操作步驟復(fù)雜、費時費工的缺點，因有操作步驟復(fù)雜、費時費工的缺點，因此目前在基因定位研究方面大多改用非此目前在基因定位研究方面大多改用非放射性標(biāo)記方式放射性標(biāo)記方式例如應(yīng)用例如應(yīng)用生物素生物素標(biāo)標(biāo)記或記或地高辛地高辛標(biāo)記來替代同位素，在生物標(biāo)記來替代同位素，在生

30、物素或地高辛上聯(lián)結(jié)熒光素或酶，再以熒素或地高辛上聯(lián)結(jié)熒光素或酶，再以熒光顯微鏡或酶聯(lián)反應(yīng)來檢測，效果亦同光顯微鏡或酶聯(lián)反應(yīng)來檢測，效果亦同樣很好。樣很好。 （五）超速離心技術(shù)（五）超速離心技術(shù)ultracentrifugationultracentrifugation 是細(xì)胞生化分析研究的基礎(chǔ)實驗方法，是分離是細(xì)胞生化分析研究的基礎(chǔ)實驗方法，是分離純化細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)和生物大分子的重要技術(shù)手純化細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)和生物大分子的重要技術(shù)手段。超離心可達(dá)幾萬段。超離心可達(dá)幾萬幾十萬轉(zhuǎn)幾十萬轉(zhuǎn)/ /分（分（g g）的）的高轉(zhuǎn)速，各種細(xì)胞亞微顆粒在離心場中的沉降高轉(zhuǎn)速，各種細(xì)胞亞微顆粒在離心場中的沉降速率不一樣

31、，衡量各種物質(zhì)顆粒在單位強度離速率不一樣，衡量各種物質(zhì)顆粒在單位強度離心場中沉降速率的量度，稱為心場中沉降速率的量度，稱為沉降系數(shù)沉降系數(shù)。沉降。沉降系數(shù)的單位叫斯維伯格單位系數(shù)的單位叫斯維伯格單位 svedberg unitsvedberg unit，簡稱簡稱“s”s”， 各種細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)顆粒各種細(xì)胞亞微結(jié)構(gòu)和蛋白質(zhì)顆粒都具有各自固定的都具有各自固定的s s值。值。 1.1.差速離心差速離心 differential centrifugationdifferential centrifugation 是利用不同離心速度所產(chǎn)生的離心力差是利用不同離心速度所產(chǎn)生的離心力差別，可將大小不同

32、的亞微結(jié)構(gòu)顆粒分離別，可將大小不同的亞微結(jié)構(gòu)顆粒分離開。此法適用于分離沉降速率差別較大開。此法適用于分離沉降速率差別較大的亞微結(jié)構(gòu)顆粒，而對于差別較小的則的亞微結(jié)構(gòu)顆粒，而對于差別較小的則應(yīng)采用密度梯度離心法。應(yīng)采用密度梯度離心法。 2 2、密度梯度離心密度梯度離心 density gradient centrifugationdensity gradient centrifugation 首先將離心溶液制備成連續(xù)或不連續(xù)增首先將離心溶液制備成連續(xù)或不連續(xù)增高的密度梯度，其密度變化的范圍與待高的密度梯度，其密度變化的范圍與待分離顆粒的密度大致相當(dāng)，然后通過一分離顆粒的密度大致相當(dāng)，然后通過一段

33、時間離心操作后，不同密度的顆粒就段時間離心操作后，不同密度的顆粒就會分別集中于與其相應(yīng)的密度梯度區(qū)帶會分別集中于與其相應(yīng)的密度梯度區(qū)帶之中，而得以分離。之中，而得以分離。 常用的密度梯度離心方法有兩種：（常用的密度梯度離心方法有兩種：（1 1）蔗糖蔗糖密度梯度離心密度梯度離心。即事先配制一系列不同濃度的。即事先配制一系列不同濃度的蔗糖溶液，分先后順序緩緩注入離心管，制成蔗糖溶液，分先后順序緩緩注入離心管，制成自下而上遞減的濃度梯度（自下而上遞減的濃度梯度（ 5 5 20% 20% 或或 10 10 60%60%）。）。 再將待分離的顆粒混合懸液加在最上再將待分離的顆粒混合懸液加在最上面。然后在

34、離心過程中，這些顆粒會在蔗糖濃面。然后在離心過程中，這些顆粒會在蔗糖濃度梯度中徐徐沉降，度梯度中徐徐沉降， 當(dāng)沉降達(dá)到平衡狀態(tài)時，當(dāng)沉降達(dá)到平衡狀態(tài)時，不同類型的顆粒便會分別集中在與其對應(yīng)的濃不同類型的顆粒便會分別集中在與其對應(yīng)的濃度區(qū)帶之中。最后掌握在顆粒區(qū)帶抵達(dá)管底前度區(qū)帶之中。最后掌握在顆粒區(qū)帶抵達(dá)管底前停止離心，按區(qū)帶分別收集樣品，進(jìn)行分析。停止離心，按區(qū)帶分別收集樣品，進(jìn)行分析。 （2 2）氯化銫密度梯度離心氯化銫密度梯度離心。氯化銫的密。氯化銫的密度梯度不需事先制備，而是在離心場中度梯度不需事先制備，而是在離心場中會自行形成穩(wěn)定的連續(xù)梯度。即在離心會自行形成穩(wěn)定的連續(xù)梯度。即在離心

35、操作前，將待分離的生物大分子懸液加操作前，將待分離的生物大分子懸液加入氯化銫溶液中。離心時，當(dāng)氯化銫形入氯化銫溶液中。離心時，當(dāng)氯化銫形成穩(wěn)定梯度后，各種生物大分子便會自成穩(wěn)定梯度后，各種生物大分子便會自動向梯度中相當(dāng)于本身浮力密度的位置動向梯度中相當(dāng)于本身浮力密度的位置移動，移動， 最終每種類型的大分子在最終每種類型的大分子在等密點等密點形成一條狹窄的帶。因此這種方法又被形成一條狹窄的帶。因此這種方法又被稱為稱為等密度梯度離心等密度梯度離心。三、細(xì)胞生理測定三、細(xì)胞生理測定 （一）細(xì)胞膜電位測定（一）細(xì)胞膜電位測定 細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)的陽離子濃度不同，通常是外細(xì)胞膜內(nèi)外兩側(cè)的陽離子濃度不同，通常

36、是外高內(nèi)低（外正內(nèi)負(fù)），造成細(xì)胞膜內(nèi)外具有一高內(nèi)低（外正內(nèi)負(fù)），造成細(xì)胞膜內(nèi)外具有一定的電位差，被稱為定的電位差，被稱為膜電位膜電位。膜電位的變化能。膜電位的變化能反映細(xì)生理變化，反映細(xì)生理變化， 譬如當(dāng)神經(jīng)興奮信號傳導(dǎo)譬如當(dāng)神經(jīng)興奮信號傳導(dǎo)時，或肌肉收縮運動時，膜電位都會發(fā)生顯著時，或肌肉收縮運動時，膜電位都會發(fā)生顯著變化。變化。 測量膜電位是采用微電極。微電極是由毛細(xì)玻測量膜電位是采用微電極。微電極是由毛細(xì)玻璃管所構(gòu)成，管內(nèi)注滿璃管所構(gòu)成，管內(nèi)注滿kclkcl溶液，溶液， 插入一根銀插入一根銀絲，銀絲用導(dǎo)線與電位計或示波器連接。測量絲，銀絲用導(dǎo)線與電位計或示波器連接。測量時使用一對微電極，

37、一個插入細(xì)胞內(nèi)，一個插時使用一對微電極，一個插入細(xì)胞內(nèi)，一個插在細(xì)胞外的介質(zhì)中，即可以電位計或示波器來在細(xì)胞外的介質(zhì)中，即可以電位計或示波器來顯示和記錄細(xì)胞內(nèi)外的電位變化。顯示和記錄細(xì)胞內(nèi)外的電位變化。 （二）細(xì)胞電泳（二）細(xì)胞電泳 cell electrophoresiscell electrophoresis 細(xì)胞表面的分子具有電荷基團(tuán)，因此在外加電細(xì)胞表面的分子具有電荷基團(tuán)，因此在外加電場作用下，懸液中的細(xì)胞都會朝正極泳動，這場作用下，懸液中的細(xì)胞都會朝正極泳動，這稱為細(xì)胞電泳。不同類型的細(xì)胞，或者處于不稱為細(xì)胞電泳。不同類型的細(xì)胞，或者處于不同生理狀態(tài)下的同種細(xì)胞，由于其細(xì)胞表面的同生

38、理狀態(tài)下的同種細(xì)胞，由于其細(xì)胞表面的電荷量有所不同，所以在同電場中的電泳速度電荷量有所不同，所以在同電場中的電泳速度不同；而在恒定條件下，同種細(xì)胞的電泳速度不同；而在恒定條件下，同種細(xì)胞的電泳速度是相對穩(wěn)定的。所以細(xì)胞電泳技術(shù)對研究細(xì)胞是相對穩(wěn)定的。所以細(xì)胞電泳技術(shù)對研究細(xì)胞癌變有重要作用。此外，細(xì)胞電泳裝置還能用癌變有重要作用。此外，細(xì)胞電泳裝置還能用來分離不同種類的活細(xì)胞。來分離不同種類的活細(xì)胞。四、其它實驗技術(shù)四、其它實驗技術(shù) （一）細(xì)胞培養(yǎng)（一）細(xì)胞培養(yǎng)cell culturecell culture 胚胎培養(yǎng)胚胎培養(yǎng)離體組織培養(yǎng)離體組織培養(yǎng)細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)細(xì)胞培養(yǎng)，細(xì)胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)的

39、基礎(chǔ)研究技術(shù)，同時在胞培養(yǎng)是細(xì)胞生物學(xué)的基礎(chǔ)研究技術(shù)，同時在醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用價值。醫(yī)學(xué)、農(nóng)業(yè)等領(lǐng)域都有廣闊的應(yīng)用價值。 原理：將生物體的某一類群細(xì)胞，甚至單個細(xì)原理：將生物體的某一類群細(xì)胞，甚至單個細(xì)胞分離出來，放入具有適合細(xì)胞生活條件的培胞分離出來，放入具有適合細(xì)胞生活條件的培養(yǎng)器皿中，維持并促進(jìn)其正常生長和繁殖。養(yǎng)器皿中，維持并促進(jìn)其正常生長和繁殖。 技術(shù)環(huán)節(jié)：細(xì)胞分離、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基。細(xì)胞技術(shù)環(huán)節(jié)：細(xì)胞分離、培養(yǎng)條件和培養(yǎng)基。細(xì)胞分離方式分離方式機械分割、酶解處理，動物組織細(xì)機械分割、酶解處理，動物組織細(xì)胞通常以胰蛋白酶消化細(xì)胞間的聯(lián)結(jié)，植物組織胞通常以胰蛋白酶消化細(xì)胞間

40、的聯(lián)結(jié)，植物組織細(xì)胞則是以纖維素酶和果膠酶消化細(xì)胞壁等聯(lián)結(jié)細(xì)胞則是以纖維素酶和果膠酶消化細(xì)胞壁等聯(lián)結(jié)物質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)條件要盡可能與生物體內(nèi)生理狀物質(zhì)。細(xì)胞培養(yǎng)條件要盡可能與生物體內(nèi)生理狀況一致，主要是培養(yǎng)溫度、況一致，主要是培養(yǎng)溫度、phph值和滲透壓等。值和滲透壓等。此外，細(xì)胞培養(yǎng)還必須保持嚴(yán)格無菌，因為離體此外，細(xì)胞培養(yǎng)還必須保持嚴(yán)格無菌，因為離體細(xì)胞已脫離了生物體免疫系統(tǒng)的保護(hù)，是極易受細(xì)胞已脫離了生物體免疫系統(tǒng)的保護(hù)，是極易受細(xì)菌、真菌等微生物的污染侵害。培養(yǎng)基的選擇細(xì)菌、真菌等微生物的污染侵害。培養(yǎng)基的選擇是決定培養(yǎng)成敗的技術(shù)關(guān)鍵，培養(yǎng)基主要成分包是決定培養(yǎng)成敗的技術(shù)關(guān)鍵，培養(yǎng)基主要成

41、分包括：各種氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽括：各種氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽以及能促進(jìn)細(xì)胞生長分裂的生長素、細(xì)胞激動素以及能促進(jìn)細(xì)胞生長分裂的生長素、細(xì)胞激動素等，動物細(xì)胞培養(yǎng)基中還需要增添等，動物細(xì)胞培養(yǎng)基中還需要增添胎牛血清胎牛血清。 細(xì)胞培養(yǎng)方式：培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、液體懸浮細(xì)胞培養(yǎng)方式：培養(yǎng)瓶培養(yǎng)、液體懸浮培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、回轉(zhuǎn)玻璃管培養(yǎng)等。培養(yǎng)、平板培養(yǎng)、回轉(zhuǎn)玻璃管培養(yǎng)等。 細(xì)胞培養(yǎng)的名詞概念：細(xì)胞培養(yǎng)的名詞概念： （1 1）傳代：當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長滿一層后，必傳代：當(dāng)培養(yǎng)細(xì)胞長滿一層后，必須分瓶接種再培養(yǎng)。須分瓶接種再培養(yǎng)。 該人為操作稱為傳該人為操作稱為傳代。代。 （2 2）原代培養(yǎng)

42、：指從組織中分離出來，原代培養(yǎng)：指從組織中分離出來，連續(xù)培養(yǎng)十代之內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)。連續(xù)培養(yǎng)十代之內(nèi)的細(xì)胞培養(yǎng)。 （3 3）繼代培養(yǎng)：連續(xù)培養(yǎng)十代以后的操繼代培養(yǎng)：連續(xù)培養(yǎng)十代以后的操作。作。 （4 4）細(xì)胞系細(xì)胞系cell linecell line：從原代培養(yǎng)物中：從原代培養(yǎng)物中接種得來的一群不均一的細(xì)胞，接種得來的一群不均一的細(xì)胞， 可長期可長期連續(xù)傳代。連續(xù)傳代。（5 5）細(xì)胞株細(xì)胞株cell straincell strain： 是從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞是從原代培養(yǎng)物或細(xì)胞系中篩選獲得的具有某種特殊遺傳特性、生化系中篩選獲得的具有某種特殊遺傳特性、生化特性和特異標(biāo)記的培養(yǎng)細(xì)胞群。特性和特異標(biāo)

43、記的培養(yǎng)細(xì)胞群。 細(xì)胞系一細(xì)胞系一般都是般都是轉(zhuǎn)化細(xì)胞轉(zhuǎn)化細(xì)胞，可以無限傳代，長期繁延下，可以無限傳代，長期繁延下去（連續(xù)細(xì)胞系）。而細(xì)胞株卻與細(xì)胞系不同，去（連續(xù)細(xì)胞系）。而細(xì)胞株卻與細(xì)胞系不同，其生存期是有限的（有限細(xì)胞系）。其生存期是有限的（有限細(xì)胞系）。 細(xì)胞（株）系是供細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)、細(xì)胞（株）系是供細(xì)胞遺傳學(xué)、細(xì)胞生理學(xué)、免疫病理學(xué)研究的好實驗材料。例如免疫病理學(xué)研究的好實驗材料。例如 helahela 細(xì)胞系是細(xì)胞系是 1953 1953 年取自一位美國黑人婦女的子宮年取自一位美國黑人婦女的子宮頸瘤上皮細(xì)胞，現(xiàn)在全世界仍采用該細(xì)胞系做頸瘤上皮細(xì)胞，現(xiàn)在全世界仍采用該細(xì)胞系

44、做人體細(xì)胞生化等研究的典型材料人體細(xì)胞生化等研究的典型材料; ; 此外此外, , 著名著名的動物細(xì)胞試驗材料的動物細(xì)胞試驗材料 - - cho cho 細(xì)胞系細(xì)胞系 （chinesechinese hamster ovary) hamster ovary) 是取自中國倉鼠卵是取自中國倉鼠卵巢組織的細(xì)胞系巢組織的細(xì)胞系 。 （6 6）克隆克隆 cloneclone 即無性繁殖系。目前有植物克隆、動物即無性繁殖系。目前有植物克隆、動物克隆、微生物克隆、胚胎克隆、細(xì)胞克克隆、微生物克隆、胚胎克隆、細(xì)胞克隆和分子克隆之分。隆和分子克隆之分。 細(xì)胞克隆即指由單個細(xì)胞培養(yǎng)繁殖而成細(xì)胞克隆即指由單個細(xì)胞培養(yǎng)繁殖而成的一群遺傳性狀完全相同的細(xì)胞群體。的一群遺傳性狀完全相同的細(xì)胞群體。如果一個細(xì)胞株是通過克隆形成法產(chǎn)生如果一個細(xì)胞株是通過克隆形成法產(chǎn)生的，的