1、實驗四 dna限制性酶切和瓊脂糖凝膠電泳 ecor i restriction enzymel識別序列識別序列 -gaatt c - - c ttaag -實驗原理-限制性內(nèi)切酶及酶切反應(yīng)bamh i restriction enzyme識別序列：識別序列： - ggatc c - - c ctagg -hind iii restriction enzyme識別序列：識別序列： - aagct t - - t tcgaa - l每一種限制性內(nèi)切酶都有特定的反應(yīng)條件：每一種限制性內(nèi)切酶都有特定的反應(yīng)條件： ph范圍：范圍： 7.58.0 緩沖液組份緩沖液組份: tris(三羥甲基氨基甲烷）、三羥

2、甲基氨基甲烷）、 nacl、 mgcl2、 溫育溫度：溫育溫度：37l反應(yīng)體系：反應(yīng)體系： dna (1ug或更少或更少) 5ul 10 x buffer 2ul restriction enzyme 3ul h2o 10ul total 20ull混勻，混勻，37度保溫度保溫30分鐘分鐘實驗原理-瓊脂糖凝膠電泳瓊脂糖瓊脂糖瓊脂糖凝膠的濃度與dna分離范圍瓊脂糖濃度(%)線型dna分子的分離范圍(kb)0.35600.61200.80.8100.90.571.20.961.50.2312.00.12電泳法的優(yōu)點1、tae電泳緩沖液電泳緩沖液 tris-base 冰醋酸冰醋酸 edta2、瓊脂糖

3、凝膠（、瓊脂糖凝膠（0.8%） 瓊脂糖：瓊脂糖：0.8g tae：100ml 試劑3、溴化乙錠、溴化乙錠(ethidium bromide，eb)leb染色液工作液濃度：染色液工作液濃度：0.010.03mg/mlleb是一種熒光染料，其扁平分子可嵌入核酸雙鏈的堿是一種熒光染料，其扁平分子可嵌入核酸雙鏈的堿基對之間，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光?；鶎χg，在紫外線激發(fā)下，發(fā)出紅色熒光。4、6 x loading dyel組成組成0.25% bromophenol blue（深藍(lán)色）（深藍(lán)色）0.4% orange g （黃色）（黃色）10mol/l tirs-hcl (ph7.5), 50mo

4、l/l edtal使用量使用量 5份份dna樣品溶液加樣品溶液加1份份blue / 6xloading dyel反應(yīng)體系：反應(yīng)體系： dna 5ul 10 x buffer 2ul hind iii 3ul h2o 10ul total 20ull混勻，混勻，37度保溫度保溫30分鐘分鐘二、電泳。1、電泳前的準(zhǔn)備工作 輕輕刷干凈電泳制膠的梳子，模板，電泳槽，用蒸餾水輕輕刷干凈電泳制膠的梳子，模板，電泳槽，用蒸餾水洗凈晾干，把制膠槽放入模板中。洗凈晾干，把制膠槽放入模板中。2、制 膠 (1)每組稱取瓊脂糖每組稱取瓊脂糖0.24g,倒入三角瓶，再往其中加入倒入三角瓶，再往其中加入 30ml電泳緩沖

5、液，微波爐加熱直到瓊脂糖溶化。電泳緩沖液，微波爐加熱直到瓊脂糖溶化。（2)每組將瓊脂糖液冷卻到約每組將瓊脂糖液冷卻到約70,輕輕倒入膠槽，并插輕輕倒入膠槽，并插 上梳子。凝固約上梳子。凝固約30min. (3)取出梳子，把膠放在電泳槽中，準(zhǔn)備電泳。取出梳子，把膠放在電泳槽中，準(zhǔn)備電泳。3、點樣和電泳 9 8 7 6 5 4 3 2 1 9 8 7 6 5 4 3 2 1(1)將酶切產(chǎn)物、自制將酶切產(chǎn)物、自制dna與與6 x loading dye混混 合，每個樣品混合后體積均為合，每個樣品混合后體積均為24ul。 a.自制自制dna 20ul + 4ul loading dye b. 酶切產(chǎn)物酶切產(chǎn)物 20ul +4ul loading dye (2)將標(biāo)準(zhǔn)將標(biāo)準(zhǔn)dna /hand iii 、dna 、酶切產(chǎn)物、自制、酶切產(chǎn)物、自制 dna各各10ul點入點樣孔。點入點樣孔。(3)電泳。電泳。(4)eb染色染色10min。（注意不要污染實驗室環(huán)境）（注意不要污染實驗室環(huán)境）-dna / hind iii markers片段大小（片段大?。?bp）和電泳帶型示意圖）和電泳帶型示意圖點樣孔點樣孔23130941665574361232220274、紫外分析儀下看