1、滑子菇液體菌種的發酵培養基優化辛偉1 洪永聰2基金項目：山東省中青年科學家科研獎勵基金（No.2009BSB01179）作者簡介：辛偉（1981-），女，碩士，實驗師，主要從事環境微生物研究等。*通訊作者：洪永聰（1977-），男，博士，講師，主要從事生物防治研究等。（1青島農業大學資源與環境學院，山東 青島 266109；2青島農業大學生命科學學院）摘要：以滑子菇液體菌種為研究對象，通過單因子、雙因子以及正交試驗，優化出最佳發酵培養基。通過單因子和雙因子試驗，優選出適合滑子菇液體培養的最佳碳源是玉米粉和葡萄糖，最佳配比為3:2；最佳氮源是麩皮和蛋白胨，最佳配比為2:1；無機鹽最佳添加量為0.

2、05%硫酸鎂和0.05%磷酸二氫鉀，生長因子最佳添加量為0.005%維生素B。通過正交試驗以及驗證，確定滑子菇液體菌種的最佳培養基配方為：玉米粉 3.0%，葡萄糖 2.0%，麩皮2.0%，蛋白胨 1.0%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，維生素B 0.005%，豆油0.03%。關鍵詞：滑子菇；液體發酵；培養基；優化Medium optimization of the batch fermentation of Pholiota namekiosXIN Wei1 HONG Yong-cong2*(1 College of Resource and Environment, Qingdao

3、 Agriculture University, Qingdao, 266109 China; 2 College of Life Science, Qingdao Agriculture University)Abstract: Single factor, double factors and orthogonal testing methods were employed for the medium optimization of the batch fermentation of Pholiota namekio.The results of single factor and do

4、uble factors experiments showed that the best carbon source should be corn flour and glucose, the best nitrogen source be wheat bran and peptone, the best addtion of inorganic salt be 0.05% magnesium sulfate and 0.05% potassium dihydrogen phosphate.The best ratio for corn flour and glucose was prove

5、d to be 3:2 and the best ratio for wheat bran and peptone be 2:1. Based on the orthogonal testing experiment, the optimal medium formulation should be 3.0% corn flour, 2.0% glucose, 2.0% wheat bran, 1.0% peptone, 0.05% magnesium sulfate, 0.05% potassium dihydrogen phosphate and 0.03% bean oil.Key wo

6、rds: Pholiota namekio; batch fermentation; medium; optimization滑子菇（Pholiota namekio），又名滑菇、光帽鱗傘，日本叫納美菇，屬于珍稀品種，滑子菇每 100g鮮菇含蛋白質 1.1g、脂肪 0.2g、糖 2.2g，并含有鈣、磷、鐵、鈉及維生素B1、B2，子實體的熱水提取物多糖體，可預防葡萄球菌、大腸桿菌、肺炎桿菌、結核桿菌的感染，是很有發展前途的保健食品和出口創匯產品1-4。培養基是提供食用菌生長繁殖和生物合成各種代謝產物所需要的、按一定比例配制的多種營養物質的混合物，培養基的恰當與否是食用菌液體培養的關鍵條件之一5-

7、8。滑子菇對碳源的利用相當廣泛，既可以利用成分復雜的、緩慢利用的復合碳源，如玉米淀粉、玉米粉等，又可以利用單糖和雙糖等小分子快速利用碳源。滑子菇對氮源的利用也相當廣泛，按其化學性質可分為無機氮，主要有銨鹽、硝酸鹽、亞硝酸鹽等；有機氮，主要包括蛋白質及其不同程度的降解物，如蛋白胨、氨基酸、酵母膏、尿素等；復合氮源，如黃豆粉、麩皮、玉米漿等。滑子菇所需的營養物質之間應有適當的比例，考慮碳源、氮源時，要注意的是快速利用的碳(氮)源和慢速利用的碳(氮源)的相互配合，發揮各自的優勢，避其所短，選用適當的碳氮比9-19。因此，本文以滑子菇為研究對象，通過單因子、雙因子以及正交試驗，研究液體菌種的最佳發酵培

8、養基配方，為滑子菇的工廠化栽培打下基礎，為滑子菇的液體發酵提供理論依據。1 材料與方法1.1 試驗材料1.1.1 供試菌種推薦精選滑子菇（Pholiota namekios），由青島旭松康大食品有限公司提供。1.1.2 種子培養基母種斜面培養基：馬鈴薯 20%，葡萄糖 2%，麥麩 3%，蛋白胨 0.5%，KH2PO4 0.15%，MgSO4 0.3%，瓊脂2%。液體種子培養基：馬鈴薯 20%，麥麩 3%，葡萄糖 1%，紅糖1%，酵母粉 0.25%，KH2PO4 0.2%，MgSO4 0.1%，維生素B1 10mg/L。1.1.3 液體發酵基礎培養基碳源供試基礎培養基：蛋白胨 0.6%，磷酸二氫

9、鉀 0.1%，硫酸鎂 0.05%，豆油0.05%，維生素B1 0.01%，再分別加入3%的各種碳源。氮源供試基礎培養基：葡萄糖 2%，磷酸二氫鉀 0.1%，硫酸鎂 0.05%，豆油 0.05%，維生素B1 0.01%，再分別加入3%的各種氮源。碳氮比供試基礎培養基：磷酸二氫鉀 0.1%，硫酸鎂 0.05%，豆油 0.05%，維生素B1 0.01%，再分別加入不同碳氮比的碳、氮源組合。硫酸鎂供試基礎培養基：葡萄糖 2%，玉米粉3%，蛋白胨 0.3%，磷酸二氫鉀 0.1%，維生素B1 0.01%，豆油0.05%。磷酸二氫鉀供試基礎培養基：葡萄糖 2%，玉米粉 3%，蛋白胨 0.3%，硫酸鎂 0.0

10、5%，維生素B1 0.01%，豆油0.05%。維生素B1供試基礎培養基：葡萄糖 2%，玉米粉 3%，蛋白胨0.3%，硫酸鎂 0.05%，磷酸二氫鉀 0.1%，豆油0.05%。1.2 試驗設計1.2.1 碳源對滑子菇液體培養的影響不同碳源對滑子菇生物量的影響：在碳源供試基礎培養基中添加5%的各種碳源，包括葡萄糖、果糖、蔗糖、麥芽糖、乳糖、可溶性淀粉、乙醇、玉米淀粉、麩皮、玉米粉等，每組試驗重復3次，通過細胞干重法測定其生物量，通過菌絲球直徑來看其形態大小，通過方格計數法測定其菌絲球數量。1.2.2 氮源對滑子菇液體培養的影響氮源對滑子菇生物量的影響：在氮源供試基礎培養基中添加各種氮源，其中，無機

11、氮（硝酸鉀、硝酸銨、氯化銨、硫酸銨）加0.6%，有機氮中蛋白胨、酵母膏、尿素為0.6%，復合有機氮（黃豆粉、麩皮、玉米漿）添加3%，每組試驗重復3次，通過細胞干重法測定其生物量，通過菌絲球直徑來看其形態大小，通過方格計數法測定其菌絲球數量。1.2.3 碳氮比對滑子菇液體培養的影響設計十個不同的處理（表1），從而確定最佳的碳氮比。測定各個處理的生物量，并測定初始pH及終點pH。試驗重復3次，記錄相應數據。表1 滑子菇液體培養的不同碳氮比處理處理abcdefghij玉米粉4443.5332.521.51葡萄糖2222222222麩皮11.52222.52234蛋白胨11111111111.2.4

12、無機鹽對滑子菇液體培養的影響硫酸鎂對滑子菇生物量的影響：在硫酸鎂供試基礎培養基中分別添加0.001%、0.003%、推薦精選0.005%等8種硫酸鎂濃度，測定各個處理滑子菇的生物量，重復3次。磷酸二氫鉀對滑子菇生物量的影響：在磷酸二氫鉀供試基礎培養基中分別添加0.01%、0.02%、0.03%等11種磷酸二氫鉀濃度，測定各個處理滑子菇的生物量，重復3次。1.2.5 維生素B對滑子菇液體培養的影響在維生素供試基礎培養基中分別添加0.001%、0.002%、0.003%等10種維生素B（B1，B2）濃度，測定各個處理滑子菇的生物量，重復3次。1.2.6 正交試驗優化滑子菇液體培養的最佳培養基根據以

13、上確定的碳源、氮源、無機鹽及維生素的含量，進行三個水平、四個因子的正交試驗（表2），每個試驗組重復3次，測定各個處理滑子菇的生物量，取平均值。根據正交試驗確定的最佳培養基結果，進行試驗驗證，進一步確定最佳培養基的組成，重復3次。表2 滑子菇液體培養基的正交試驗因素水平表因素水平玉米粉（A）葡萄糖（B）麩皮（C）蛋白胨（D）12.5%1.5%1.5%0.5%23.0%2.0%2.0%1.0%33.5%2.5%2.5%1.5%1.3 滑子菇的液體發酵條件滑子菇的液體培養采用500ml錐形瓶，裝400ml培養基，接種量為0.1%，采用通氣式培養6d，前3d采用通氣量為60L/min的氣泵，后三天采用

14、通氣量85L/min的氣泵，22±1下培養。1.4 滑子菇液體發酵生長量的檢測方法1.4.1 菌絲球數量的測定取5ml的發酵液，按比例在量筒中加水稀釋，搖勻后取lml在直徑1.5cm的培養皿中攤勻，培養皿下墊黑白相間的格紙，用方格計數法計數。1.4.2 菌絲球直徑的測定隨機取菌球20個，成直線排列，測其總長度，重復3次，取平均值。1.4.3 生物量的測定細胞干重法取5ml的發酵液，40目過篩，菌絲體經蒸餾水充分洗滌，80真空干燥至恒重，電子天平準確稱重，按下式計算生物量：生物量(kg/m3)=(DCB/V)*l05，式中DCB為細胞干重(kg)，V為取樣體積(ml)。1.4.4 發酵

15、液pH的測定取發酵液5ml，采用便攜式pH計直接測量。1.5 數據分析試驗數據采用計算機統計軟件 Microsoft Excel與SAS-8進行分析。各處理平均數間的多重比較采用鄧肯氏新復極差測驗(Duncan)，差異顯著性水平定為=0.05，極差異顯著性水平定為=0.01。2 結果與分析2.1 滑子菇液體發酵培養基的最佳碳源選擇不同碳源對滑子菇生物量影響的測定結果（表3）顯示：在單糖和雙糖中，滑子菇對葡萄糖的利用效果最好，菌絲干重達到76.51mg/ml，其次是麥芽糖，而對蔗糖的利用效果最差，這一結果說明醛糖比酮糖更容易被滑子菇菌絲利用。在多糖中，玉米淀粉是滑子菇最好的碳源，菌絲干重達到61

16、.08mg/m1，其次是麩皮、玉米粉，而對可溶性淀粉的利用效果最差。此外，滑子菇對醇類的利用效果是所有碳源中最差的，菌絲干重僅為12.45mg/m1。推薦精選表3 不同碳源對滑子菇生物量的影響碳源菌絲干重（mg/ml）菌球直徑（mm）菌球數量（個/ml）葡萄糖76.51a3.87d436c果糖65.32b3.53e401d蔗糖40.13d4.19c236e麥芽糖73.91ab4.02cd442c乳糖63.99b4.21c396d可溶性淀粉32.68e5.01ab460bc乙醇12.45f2.31f108f玉米淀粉61.08b5.31a489ab麩皮58.42bc4.87b477b玉米粉53.2

17、3c5.26a502a2.2 滑子菇液體發酵培養基的最佳氮源選擇不同氮源對滑子菇生物量影響的測定結果（表4）顯示：滑子菇對大多數有機氮的利用效果較好，可以說，麩皮、玉米漿、黃豆粉、蛋白胨都是不錯的氮源，生物量都較高，但滑子菇對尿素的利用效果最差，菌絲干重僅為22.3mg/m1。表4 不同氮源對滑子菇生物量的影響碳源菌絲干重（mg/ml）菌球直徑（mm）菌球數量（個/ml）硝酸鉀39.1d3.31d376bc硝酸銨54.9b3.87c388b氯化銨43.1c3.34d333c硫酸銨42.0c3.21d321c蛋白胨63.3ab4.55b405ab酵母膏52.1b2.99e297d尿素22.3e1

18、.11f109e黃豆粉65.2ab4.87ab433a麩皮70.10a5.22a401ab玉米漿68.9a4.50b422a2.3 滑子菇液體發酵培養基的最佳碳氮比選擇不同碳氮比對滑子菇生物量和pH影響的測定結果（圖1）顯示：不同的碳氮比對滑子菇的生物量有很大影響，在碳源在一定的范圍內，隨著氮源的增加，生物量也隨著逐漸增加，當碳氮比組合為e時（玉米粉：葡萄糖：麩皮：蛋白胨為3:2:2:1），生物量達到最大值。而當氮源一定時，生物量會隨著碳源的減少而減少。但從圖不難看出，碳源、氮源并非是越多越好，其必須有一恰當的配比才能達到最好的效果。碳氮比不僅對生物量有影響，其對培養基的pH也有一定的影響。測

19、定培養基滅菌后的pH值，發現，氮源過多是，HP值會偏高；而碳源過多時，會出現HP值會偏低。不同的起始pH值導致了培養終點的不同的pH值。可以看出，兩條曲線基本是平行的，說明在培養的過程中，pH值的變化基本是相同的。但是，由于過高或過低的pH值都不利于菌絲的生長。推薦精選圖1 不同碳氮比對滑子菇生物量、初始pH和終點pH的影響綜上所述，可以得出：氮源過多，則菌體繁殖旺盛，pH值偏高，不利于代謝產物的積累；氮源不足，則菌體衰老和自溶。另外，碳氮比不當還會影響菌體按比例吸收營養物質，直接影響菌體生長和產物的形成。從中可以看出，滑子菇對碳的需求要比氮的量多，這是由于碳既做碳架又做能源，所以用量要比氮多

20、。2.4 滑子菇液體發酵培養基的無機鹽添加量確定硫酸鎂添加量對滑子菇生物量影響的測定結果（圖2）表明：與對照相比，添加不同量的硫酸鎂會對菌絲生長有一定的促進作用。當添加量小于0.05%時，隨著其含量的增加，滑子菇生物量也成正比例增加，當含量為0.05%時，達到最大值；然后，生物量隨著硫酸鎂含量的增加成下降趨勢。這說明，低濃度的硫酸鎂對菌絲生長有促進作用，高濃度反而不利于其生長。所以，在滑子菇液體培養基中應添加硫酸鎂的量為0.05%。圖2 硫酸鎂添加量對滑子菇生物量的影響磷酸二氫鉀添加量對滑子菇生物量影響的測定結果（圖3）表明：磷酸二氫鉀的添加會對菌體生長有重要影響，濃度低于0.05%時，菌體生

21、長會與其成正比例的增加，濃度大于0.05%后，促進效果會逐漸減差，這說明磷酸二氫鉀的促進濃度最佳為0.05%。另外，其也是緩沖液，有助于培養基維持菌絲所適的酸堿度，有利于菌絲的生長。推薦精選圖3 磷酸二氫鉀添加量對滑子菇生物量的影響2.5 滑子菇液體發酵培養基的維生素添加量確定維生素B添加量對滑子菇生物量影響的測定結果（圖4）表明：添加維生素B對菌體的生長有明顯的促進作用，生物量有了顯著提高。按本試驗的培養基，當維生素B的含量為0.005%時，促進效果最好。圖4 維生素B添加量對滑子菇生物量的影響2.6 滑子菇液體發酵培養基的優化根據以上的單因子試驗中的結果，選擇出了最適碳源、氮源、無機鹽的含

22、量以及合適的維生素的含量，進行三個水平四個因子的正交試驗，各處理調pH值為6.5，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，維生素B 0.005%，豆油0.03%。每個試驗組重復三次，取平均值，根據正交試驗的結果，確定最佳培養基的組成。滑子菇液體發酵培養基正交試驗的統計分析結果（表5）表明：由極差結果可知，玉米粉（A）含量對菌絲干重的影響最大，因此，在培養基中要控制好其含量；對蛋白胨（D）和麩皮（C）的含量也要控制；而對葡萄糖（B）的用量要求就不是很嚴格了。從極差分析結果來看，使生物量最大的因子水平組合應是A2B2C2D2。推薦精選表5 滑子菇液體發酵培養基正交試驗的統計分析結果因素處理玉米粉（

23、A）葡萄糖（B）麩皮（C）蛋白胨（D）菌絲干重（mg/ml）12.5%1.5%1.5%0.5%73.2822.5%2.0%2.0%1.0%83.5632.5%2.5%2.5%1.5%70.6443.0%1.5%2.0%1.5%78.2153.0%2.0%2.5%0.5%85.6463.0%2.5%1.5%1.0%82.4173.5%1.5%2.5%1.0%76.1483.5%2.0%1.5%1.5%75.3393.5%2.5%2.0%0.5%80.31K1227.5227.6231.0239.2K2246.3244.5242.1242.1K3231.8233.4232.4224.2R18.81

24、6.911.117.93 結論因此，很容易發現，在復合碳源中，玉米淀粉和玉米粉在生物量、菌球直徑以及菌球數方面都是最佳的碳源，而小分子則以葡萄糖、果糖最佳。考慮到生產中的成本，確定以玉米粉為復合碳源，小分子以葡萄糖為碳源。由于復合碳源是緩慢利用的營養物質，而小分子碳源有快速被菌體吸收的特點，為了相互彌補不足，通過在復合碳源中添加小分子碳源來達到最佳碳源的效果。其原因是，小分子碳源葡萄糖在前期提供碳源，使滑子菇在短期內大量生長縮短了停滯期，快速進入生長期；而復合碳源玉米粉在后期及時的補充了營養，滿足了菌絲體的營養需求，使其在對數生長期、穩定期均有較好的營養條件。從而，兩者的最佳配比可以相互補充，

25、使滑子菇的菌絲干重達到最多。另外，通過以上分析不難發現，兩者的最佳配比還可以縮短發酵周期，主要是小分子葡萄糖縮短了停滯期，從而使整個培養過程縮短8小時左右。由以上分析得知，最佳的碳源即為3%玉米粉和2%葡萄糖，能夠達到最多的生物量，花費最短的培養時間，從經濟效益出發，是最符合實際生產的碳源組合。就無機氮而言，雖然滑子菇可以利用，但其效果不是很好。因為使用無機氮源時，菌絲必須利用無機氮合成其需要的各種氨基酸，而某些氨基酸幾乎或者完全不能生物合成，另一方面可能的原因是，由于NH4+的利用會使培養基酸化，而NO3-則更易使培養基pH升高，從而導致不恰當的pH值，影響了菌絲的生長。因此，滑子菇雖然能利

26、用無機氮，但生長緩慢，生物量較低。有機氮效果好的原因可能是，有機氮源中含有豐富的蛋白質、多肽、脂肪酸、維生素、游離氨基酸且氨基酸的種類較齊全，滑子菇能直接利用氨基酸和其他有機含氮化合物中的各種不同結構的骨架來合成菌體生長所需要的蛋白質和其他細胞物質，而無需從糖代謝的分解產物中來合成各種所需的物質。另一方面，滑子菇在分泌淀粉酶后才能利用培養基中的緩慢利用碳源物質，在此之前，無機氮源和蛋白胨等快速利用氮源在碳源缺乏的條件下，有可能部分充當了提供能源的角色，因此影響了最終菌體生長階段對氮源總量的需求。另外，在選擇氮源時，還要考慮培養基產生泡沫的情況，在以上的氮源中，玉米漿、黃豆粉與其它氮源相比，產生

27、的泡沫最多，泡沫的增多，會使氧傳遞系數減少，嚴重時造成大量逃逸，發酵液從排氣管路或軸封逃出而增加染菌機會，所以，最佳的氮源是麩皮、蛋白胨。而麩皮是遲效氮源，蛋白胨是速效氮源，兩者的合理配比將會達到最佳的效果。通過驗證試驗，按A2B2C2D2的配方進行三次試驗，結果是菌絲干重達到88mg/m1，這說明了滑子菇液體發酵的最佳培養的配方應是：玉米粉 3.0%，葡萄糖 2.0%，麩皮2.0%，蛋白胨 1.0%，硫酸鎂0.05%，磷酸二氫鉀0.05%，維生素B 0.005%，豆油0.03%。推薦精選參考文獻：1 袁廣峰，李永文，張樹斌，等. 滑菇黏液成分分析及免疫促進作用研究J. 食品科學. 2008,

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