1、畢業(yè)論文加減三黃湯對(duì)感染耐藥大腸桿菌鼠il-2、il-6 和no的影響the effects of il-2, il-6 and no from mose effected resistance e.coli by modified three yellow soups姓 名： 指導(dǎo)教師： 院 系：動(dòng)物科技學(xué)院動(dòng)物醫(yī)學(xué)系專(zhuān) 業(yè)：動(dòng)植物檢疫年 級(jí)：2007級(jí)動(dòng)植物檢疫本科班論文提交時(shí)間：2011年6月9日目錄引 言- 3 -1 材料與方法- 4 -1.1 材料- 4 -1.1.1 試驗(yàn)藥品- 4 -1.1.2 試驗(yàn)菌株- 4 -1.1.3 儀器設(shè)備- 4 -1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物- 4 -1.2

2、方法- 4 -1.2.1 試驗(yàn)菌液的制備- 4 -1.2.2 抑制劑配方的制定及提取物的制備- 5 -1.2.3 最小抑菌濃度（mic）的測(cè)定- 5 -1.2.4 中藥抑制劑與耐藥性大腸桿菌使用量的確立- 5 -1.2.5 分組與模型制作- 5 -1.2.6 相應(yīng)測(cè)定體重變化胸腺、脾免疫器官指數(shù)- 5 -1.2.7 組織勻漿制備，血清及組織勻漿因子檢測(cè) no試劑盒檢測(cè)免疫力- 6 -1.2.8 統(tǒng)計(jì)結(jié)果，確定中藥組方療效- 7 -2 結(jié)果- 7 -2.1 中藥抑制劑在機(jī)體中最佳使用劑量- 7 -2.2 耐藥大腸桿菌最佳攻毒量- 7 -2.3 實(shí)驗(yàn)期間各組死亡情況與療效結(jié)果- 7 -2.3.1自

3、然死亡情況- 7 -2.3.2療效- 8 -2.4各組小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)定結(jié)果；- 8 -2.5 血清及組織細(xì)胞因子檢測(cè)- 8 -2.5.1 no對(duì)小鼠免疫功能的影響- 8 -2.5.2白介素2對(duì)鼠免疫功能的影響- 9 -2.5.3 白介素6對(duì)鼠免疫功能的影響- 9 -3討論- 9 -3.1 討論- 9 -3.1.1促進(jìn)機(jī)體免疫器官的發(fā)育，提高機(jī)體免疫力- 9 -4結(jié)論- 10 -參考文獻(xiàn)- 11 -致謝- 12 -加減三黃湯對(duì)感染耐藥大腸桿菌鼠il-2、il-6和no的影響范建超動(dòng)物科技學(xué)院 07級(jí)動(dòng)植物檢疫專(zhuān)業(yè)本科班指導(dǎo)教師：尹秀玲中文摘要：目的：探討加減三黃湯對(duì)多重耐藥性大腸桿菌病的影

4、響。方法：確定加減三黃湯（2g/ml）對(duì)高度耐藥的人源2952(o142+o26+o13)菌株的接種量以原液的0.5ml（2.4×109cfu）。選取健康的30只小白鼠，隨機(jī)分為健康組，陽(yáng)性對(duì)照組和攻毒治療組。自感染試驗(yàn)菌第1天起，試驗(yàn)組每只小鼠每天分別灌服中藥制劑提取物0.5ml，連續(xù)7d。在感染后第8d，隨機(jī)抽取測(cè)定生化指標(biāo)，剖檢測(cè)定免疫器官指數(shù)，血清及組織細(xì)胞因子il-2、il-6、no含量。結(jié)果：加減三黃湯對(duì)人工感染耐藥e.coli后可以顯著提高血清及組織因子il-2的含量，no的含量影響肝脾的恢復(fù)。結(jié)論：加減三黃湯對(duì),多重耐藥性大腸桿菌能起到一定的耐藥逆轉(zhuǎn)作用，對(duì)動(dòng)物機(jī)體具

5、有一定的免疫保護(hù)作用。關(guān)鍵詞：耐藥性大腸桿菌， il-2，il-6，nothe effects of il-2, il-6 and no from mose effected resistance e.coli by modified three yellow soupsfan jianchao(animal and plant quarantine, college of animal science and technology ) guide teacher: yin xiuling abstract : objective: the effect of modified three y

6、ellow soups(mtys) by modified was investigated on multidrug resistant e.coli. methods：the 2g/ml inoculum of multiple drug resistance to no. 10 e. coli was determined and inoculated by 0.5ml (2.4 × 109cfu) in vivo test. the 30 mouse were randomly arranged into 3 groups, the positive control and

7、experiment group were inoculated with the 0.5ml extractive of mtys each day for seven days. after the eight days, some slikies fowl were randomly taken from each group for detecting blood serum biochemical indicator , immune organ index and the content of serum and organization of cytokines il - 2,

8、il-6 and no,. results: mtys had very obviously effect on varying degrees of increase in immunity. il-2 levels and no content were increase significantly of serum and tissue factor,then effect the recovery of the liver and spleen. conclusions: mtys had obviously inhibitory effect to resistant multidr

9、ug e.coli and immunoprotection on creature.key words: the resistant e.coli isolated from mouse ; inhibitor; biochemical indicator; il-2, il-6 and no引 言大腸桿菌是畜禽的重要致病菌，隨著大腸桿菌耐藥株的不斷增多，大腸桿菌感染及其食品污染有不斷上升的趨勢(shì)，尤其是人類(lèi)食物中毒和胃腸炎的不斷暴發(fā)已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)，因此，控制耐藥菌的傳播和防治細(xì)菌感染己成為一個(gè)世界性難題。在細(xì)菌性疾病中大腸桿菌是獸醫(yī)臨床感染中的常見(jiàn)病原菌, 其病原抗原較復(fù)雜，在臨床上表

10、形癥狀和剖檢病理變化也較多，給養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)了重大損失。自從1940年青霉素問(wèn)世以來(lái)，很多抗生素在各種常見(jiàn)細(xì)菌性疾病的治療中發(fā)揮了重要的作用。但隨著抗生素的廣泛應(yīng)用，越來(lái)越多的病原菌產(chǎn)生了耐藥性，而且耐藥性嚴(yán)重。尤其大腸桿菌對(duì)青霉素類(lèi)（青霉素耐藥率為99.05%）、大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)（紅霉素耐菌率為79.72%）、氨基糖苷類(lèi)（鏈霉素耐菌率為48.98%，慶大霉素耐菌率為43.88%）、諾酮類(lèi)（氧氟沙星耐菌率為37.76%）耐藥性都很高1-2。如果對(duì)大腸桿菌耐藥性處理不好，發(fā)展成超級(jí)菌，那將對(duì)感染畜禽的治療將帶來(lái)很大的困難。目前對(duì)多重耐藥性大腸桿菌抑制劑的研究已有很多報(bào)道，但對(duì)抗耐藥性大腸桿菌中藥抑制劑的研

11、究報(bào)道較少。我國(guó)有著得天獨(dú)厚的中藥資源，中藥在治療感染方面顯示了獨(dú)特的作用，同時(shí)中藥具有資源豐富、作用靶位多、毒副作用較小、價(jià)格便宜及體內(nèi)使用安全等優(yōu)點(diǎn)。中草藥的活性成分可抑制耐藥性大腸桿菌主動(dòng)外輸系統(tǒng)，使耐藥性大腸桿菌消除其耐藥性3-4。本試驗(yàn)以耐藥機(jī)制清楚、致病作用強(qiáng)的人源性大腸桿菌作為研究對(duì)象，利用以黃連、黃芩、黃柏清熱解毒為主的中藥三黃湯，佐以大黃清熱兼能活血散瘀，共達(dá)清熱解毒、活血散瘀的功效5。以芩柏龍膽散治療大腸桿菌病模型鼠，結(jié)果該方劑可有效降低大腸桿菌病的死亡率，緩解其內(nèi)臟病變的程度，保護(hù)病鼠的精神和食欲，加速康復(fù)過(guò)程，來(lái)消除其多重耐藥6-7。據(jù)報(bào)道，中藥的活性成分能夠明顯抑制耐

12、藥大腸桿菌的外輸系統(tǒng)，對(duì)r質(zhì)粒具有明顯的消除作用8。通過(guò)對(duì)傳統(tǒng)中藥三黃湯加減配成不同組方，觀察體外抑菌效果，篩選出能夠抑制大腸桿菌藥物耐藥性的抑制劑，來(lái)消除其多重耐藥。通過(guò)探討其對(duì)不同耐藥程度的大腸桿菌的影響，選取有效藥物進(jìn)行合理組方，通過(guò)與抗生素聯(lián)合增敏試驗(yàn)，確定最佳組方。然后對(duì)中藥組方作用于感染大腸桿菌鼠前后血液生理生化指標(biāo)檢測(cè)，分析中藥組方對(duì)機(jī)體的保護(hù)作用，從分子生物學(xué)角度研究藥物對(duì)大腸桿菌的作用機(jī)制，本實(shí)驗(yàn)先通過(guò)在體外對(duì)人源大腸桿菌進(jìn)行臨床分離細(xì)菌鑒定、分離培養(yǎng)、血清型鑒定和耐藥性檢測(cè)，然后再將分離鑒定的菌株回歸到動(dòng)物體內(nèi)，對(duì)小鼠的免疫力進(jìn)行檢測(cè)，獲取有效組方應(yīng)用于臨床，可為該病今后防

13、治提供一定依據(jù)。1 材料與方法1.1 材料1.1.1 試驗(yàn)藥品 黃連、厚樸、苦參、大青葉、穿心蓮、黃芩、黃柏、木香、甘草、黃芪、茯苓、均購(gòu)自張家口醫(yī)藥公司。營(yíng)養(yǎng)肉湯 北京海淀區(qū)微生物培養(yǎng)基制品廠生產(chǎn)。麥糠凱瓊脂 北京陸橋技術(shù)有限責(zé)任公司生產(chǎn)。1.1.2 試驗(yàn)菌株 經(jīng)臨床分離9生化鑒定的人源大腸桿菌進(jìn)行血清型鑒定，獲得致病性高度耐藥的人源2952(o142+o26+o13)菌株。（北京天壇生物制品檢定所鑒定，本室保存）。1.1.3 儀器設(shè)備 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器、ldzx-40b1型不銹鋼立式自動(dòng)電熱蒸汽壓力滅菌器、szx-01型超靜工作臺(tái)、skp-01型電熱恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、微量加樣器、愛(ài)林牌wzr

14、x1微量吸液器 蘇州市東吳醫(yī)用電子儀器廠，cap-ria 16 gamma counter 美國(guó)產(chǎn)，ft-614混勻器 核工業(yè)部，北京和儀器廠，hh-w21-420bs電熱很溫水浴箱，上海躍進(jìn)醫(yī)用光學(xué)器械廠，541-10000-00-0 heidolph 振蕩器 reax top glasblasreei-krankenhausbedarf laboreinrichtungen. hassa laborbedarf 24 200 anthos fluido 洗板機(jī)，anthos labtec instruments 128c 酶標(biāo)儀 clinibio。1.1.4 試驗(yàn)動(dòng)物 100只小白鼠 購(gòu)自

15、河北北方學(xué)院附屬實(shí)驗(yàn)?zāi)翀?chǎng)。1.1.5 試劑 碘125i白細(xì)胞介素-2放射免疫分析藥盒說(shuō)明書(shū) 北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司 碘125i白細(xì)胞介素-6放射免疫分析藥盒說(shuō)明書(shū) 北京普爾偉業(yè)生物科技有限公司 血清因子il-2、il-6、no試劑盒購(gòu)自上海滬峰試劑有限公司。1.2 方法1.2.1 試驗(yàn)菌液的制備 將分離并篩選人源性大腸桿菌菌株10進(jìn)行復(fù)蘇培養(yǎng)18h24h。在無(wú)菌操條件下，吸取20ul菌液，接種于含2.0ml營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基試管中，按10-1、10-2、10-3、，十進(jìn)位稀釋?zhuān)?7培養(yǎng)。每種菌株做兩個(gè)重復(fù)。采用顯微鏡直接計(jì)數(shù)法進(jìn)行活菌計(jì)數(shù)，配成約含菌量為109cfu/ml的菌懸液。1.2.

16、2 抑制劑配方的制定及提取物的制備 根據(jù)傳統(tǒng)中藥理論和配伍原則及三黃湯配方進(jìn)行加減，制成如下配方：中藥制劑（mtys）黃芩12g、黃連12g、黃柏12g、穿心蓮9g、苦參9g、金銀花15g、大青葉15g、木香6g、甘草9g、厚樸9g、黃芪9g、茯苓9g，水煎劑。1.2.3 最小抑菌濃度（mic）的測(cè)定 采用試管兩倍稀釋法，對(duì)所制備的中藥mtys提取物需先測(cè)定其對(duì)該菌株的mic值，細(xì)菌接種量約為109cfu/ml，同時(shí)做陰性、陽(yáng)性對(duì)照，每一濃度藥液做兩個(gè)平行，以平均值為最終結(jié)果。同時(shí)將各培養(yǎng)細(xì)菌劃線接種于相同中藥濃度營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，再次觀察各菌株的藥敏試驗(yàn)結(jié)果并記錄。判定標(biāo)準(zhǔn)為：無(wú)大腸桿菌生長(zhǎng)

17、的最小藥液濃度為該藥物對(duì)該菌株的最小抑菌濃度（mic）。1.2.4 中藥抑制劑與耐藥性大腸桿菌使用量的確立 1.2.4.1 中藥抑制劑在機(jī)體中使用劑量的確立 取30只體重均勻的小白鼠，隨機(jī)分為6組，每組5只，各組小鼠分別灌服不同計(jì)量的mtys 中藥提取物，1次/d，用藥期7d，停藥2d，第8天稱(chēng)其體重，求其平均值。每天觀察每組小鼠的采食、飲水、行為及死亡情況，并對(duì)精神沉郁的小鼠和死亡的小鼠進(jìn)行剖檢和細(xì)菌培養(yǎng)，以確定mtys的用藥量。1.2.4.2 耐藥大腸桿菌最佳攻毒量的確定 取60只體重均勻的小鼠，隨機(jī)分成3組，每組20只，按組分別腹腔注射不同劑量人源2952(o142+o26+o13)菌株

18、菌液，每天觀察每組小鼠的采食、飲水、行為及死亡情況，觀察10d，死亡小鼠作病理剖檢和菌檢，確定死亡原因，最后計(jì)算死亡率。1.2.5 分組與模型制作 健康小白鼠60只，常規(guī)飼養(yǎng)7d后隨機(jī)分為7組，分別編號(hào)：健康組a組、攻毒2952組b組、攻毒2952+mtys組c組每組20只，除a組外，其余組按每只小鼠腹腔注射試驗(yàn)菌液0.2ml（約含菌1.6×109cfu）進(jìn)行攻毒，a組腹腔注射生理鹽水0.2ml。自造模第1天起，a、b組每日上午10：00灌服生理鹽水0.5ml，c組灌服濃縮為1g/ml的mtys浸提制劑0.5ml，連續(xù)7d。 1.2.6 相應(yīng)測(cè)定體重變化胸腺、脾免疫器官指數(shù) 攻毒喂藥

19、后第8d，分別從各組小鼠群中空腹稱(chēng)重，統(tǒng)計(jì)mtys對(duì)小鼠增重的影響，然后屠宰，摘取胸腺、脾稱(chēng)重，計(jì)算其免疫器官指數(shù)（免疫器官重宰前空腹活重×100），即以免疫器官的克數(shù)占千克體重的份額（g/kg）表示。各組小鼠在感染前和試驗(yàn)結(jié)束時(shí)分別稱(chēng)重1次，測(cè)定胸腺、脾重，根據(jù)小鼠的體重變化，計(jì)算每組小鼠的平均體重和標(biāo)準(zhǔn)差11。1.2.7 組織勻漿制備，血清及組織勻漿因子檢測(cè) no試劑盒檢測(cè)免疫力 按照說(shuō)明書(shū)方法，鼠(mouse）一氧化氮（no）elisa檢測(cè)試劑盒：樣血清操作過(guò)程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，1000×g離心10分鐘將血紅細(xì)胞迅速小心地分離

20、。組織勻漿將組織加入適量生理鹽水搗碎。1000×g 離心10分鐘，取上清液。操作：使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時(shí)加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。根據(jù)待測(cè)樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個(gè)樣品根據(jù)自己的數(shù)量來(lái)定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50u1于反應(yīng)孔、加入待測(cè)樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50u1的生物素標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37溫育45分鐘。甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。每孔加入1

21、00u1的親和鏈酶素一hrp，輕輕振蕩混勻，37溫育30分鐘。甩去孔內(nèi)液休，每孔加滿(mǎn)洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作4次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。每孔加入底物a, b各50u1，輕輕振蕩混勻，370溫育5分鐘。避免光照。取出酶標(biāo)板，迅速加入50u1終止液，加入終止液后應(yīng)立即測(cè)定結(jié)果。在450nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的od值12。 il-2、il-6試劑盒檢測(cè)免疫力： 血清：取靜脈血2m1,注入試管待凝固后，4 3000rpm離心，10min,分離血清。放-20，樣品可保存2個(gè)月，放-70以下可存放半年。測(cè)定前使樣本置于室溫或冷水中復(fù)融， 再次403000rpm離心

22、，5 min,取上清測(cè)定。注：測(cè)定兔血漿時(shí)，應(yīng)改用25peg 500p1作分離劑，離心前nsb、s0 、s1-s6管補(bǔ)加球蛋白100l,樣品管加pbs各100l ,然后再加25 % peg 500l。測(cè)兔血清時(shí)最好每個(gè)標(biāo)本做一個(gè)u0 ,25peg和球蛋白由我公司提供。 組織：取出活組織，吸去血跡，稱(chēng)重，盡快加入生理鹽水1ml碾磨，制成勻漿，43000rpm離心，15min,取上清，-20以下保存。測(cè)定前最好做預(yù)實(shí)驗(yàn)確定樣品稀釋度。取3-5份做小樣，可將樣品做原倍，1：5，1：20倍稀釋?zhuān)x擇合適的稀釋度。 另外，每種組織的樣品非特異結(jié)合（u0）可能有些差異，每份標(biāo)本最好申獨(dú)做一個(gè)uo或每組做一

23、個(gè)u0。取組織的重量一般在300-400mg左右為好。 細(xì)胞培養(yǎng)液或其它體液：如樣品濃度高，可直接加樣測(cè)定，如濃度低需將樣品濃縮5-10倍，再加樣測(cè)足，可取樣品0.5ml，加入測(cè)量用的放免塑料管中再冷凍干燥機(jī)上冷凍抽干，用0.1 ml生理鹽水復(fù)融，做為樣品管直接測(cè)定。 本實(shí)驗(yàn)采用平衡法，取聚苯乙烯試管編號(hào)，按下表操作。 il-6 ria加樣程序（l）pr分離劑一 500 500 500 500 500充分混勻，室溫放置20min, 4 3500rpm離心25min,吸棄上清，測(cè)個(gè)沉淀管，cpm數(shù)。雞il-2試劑盒檢測(cè)同上，在河北北方學(xué)院一附院檢驗(yàn)科測(cè)定。 1.2.8 統(tǒng)計(jì)結(jié)果，確定中藥組方療效

24、 所有實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均用t檢驗(yàn)軟件進(jìn)行分析，計(jì)量資料以 ±s表示，并進(jìn)行t 檢驗(yàn)分析。2 結(jié)果2.1 中藥抑制劑在機(jī)體中最佳使用劑量 為了在體內(nèi)試驗(yàn)時(shí)，中藥mtys提取物的濃度能夠在體內(nèi)達(dá)到一定的藥物濃度，又不影響機(jī)體的正常發(fā)育，中藥mtys的使用劑量，每只小鼠以2g為宜13。2.2 耐藥大腸桿菌最佳攻毒量 耐藥性大腸桿菌人源2952(o142+o26+o13)菌株每只小鼠的接種量以原液的0.5ml（2.4×109cfu）為宜。2.3 實(shí)驗(yàn)期間各組死亡情況與療效結(jié)果2.3.1自然死亡情況 在攻毒前對(duì)隨機(jī)抽取的小鼠在無(wú)菌條件下剖檢觀察和細(xì)菌培養(yǎng)，沒(méi)有發(fā)現(xiàn)感染大腸桿菌。說(shuō)明，人工造模

25、是在沒(méi)有感染大腸桿菌的前提下進(jìn)行的。在人工病模試驗(yàn)，治療組和細(xì)菌感染組小鼠在攻毒后8小時(shí)，部分小鼠出現(xiàn)不同程度的大腸桿菌臨床癥狀，主要表現(xiàn)為精神不振，輕度腹瀉、食欲減退，嚴(yán)重者食欲廢絕等。陽(yáng)性對(duì)照和用藥組均在感染18h后開(kāi)始死亡，治療后的第5天臨床病癥明顯減輕，而陽(yáng)性對(duì)照組從攻毒開(kāi)始至第8天，臨床癥狀嚴(yán)重者陸續(xù)死亡，到第9天存小鼠臨床病癥基本消失。 2.3.2療效 試驗(yàn)結(jié)束后增重情況可以看出，陽(yáng)性對(duì)照試驗(yàn)結(jié)束時(shí)增重最少為27.9% ，陽(yáng)性對(duì)照組和給藥組差異顯著（p0.05）；給藥組與健康組之間差異極顯著（p0.01）。死亡率、有效率和治愈率，陽(yáng)性對(duì)照組、實(shí)驗(yàn)組，從治療開(kāi)始到第10天結(jié)束時(shí)小鼠死

26、亡率分別為50%和36%，健康組小鼠的死亡率為0。由此可見(jiàn)，小鼠的死亡率，陽(yáng)性對(duì)照與給藥組之間有效率存在顯著性差異（p0.05）。經(jīng)過(guò)治愈陽(yáng)性對(duì)照組和mtys給藥組、存在差異（p0.05）。表1 耐藥性大腸桿菌攻毒量對(duì)鼠的影響table 1 the effect of resistant e.coli conteracting toxic substances quanity on mice攻毒菌株組別只數(shù)攻毒量（ml）含活菌數(shù)（cfu）精神沉郁（只） 死亡數(shù)（只）死亡率（%）人源2952組100.43.2×109010100組100.21.6×1091333組100.10

27、.8×109000注：各觀察縱項(xiàng)指標(biāo)之間“*”表示差異顯著（p0.05）；“#”表示在不給藥的情況下自己好轉(zhuǎn)或自愈；a與b、b與c、c與d之間表示差異顯著（p0.05），a與c,b與d表示差異極顯著（p0.01）；相同字母表示差異不顯著（p0.05）；“-”表示沒(méi)有計(jì)算。2.4各組小鼠免疫器官指數(shù)的測(cè)定結(jié)果；表顯示經(jīng)2751、2952攻毒后，鼠的脾指數(shù)、肝指數(shù)變化不明顯，經(jīng)mtys和mss治療后，mss組可以顯著提高鼠的肝指數(shù)，其它不明顯。表2 鼠免疫器官指數(shù)結(jié)果 table 2 results of immune organs index on mice (g/kg)組別脾指數(shù)（g

28、/g）肝指數(shù)（g/g）陰性對(duì)照組a組0.004±0.0020.029±0.317攻毒2952組b組0.003±0.0000.025± 0.124攻毒2952+mtys組c組0.005±0.0010.045± 0.091注：*表示陰性對(duì)照組比差異顯著p0.052.5 血清及組織細(xì)胞因子檢測(cè)2.5.1 no對(duì)小鼠免疫功能的影響 小鼠經(jīng)人工感染耐藥大腸桿菌后，血液中陽(yáng)性對(duì)照組極顯著低于治療組和健康組，肝中陽(yáng)性對(duì)照組和攻毒治療組no的水平顯著高于健康組，脾中no的水平陽(yáng)性對(duì)照組極顯著高于治療組和健康組，說(shuō)明感染耐藥大腸桿菌后顯著降低了血液中的

29、no水平，極顯著增加肝、脾的水平。經(jīng)過(guò)治療后，血液、脾臟的水平逐漸恢復(fù)正常，而肝內(nèi)水平持續(xù)走高。表3 小鼠人工感染大腸桿菌治療前后的no量的變化(ng/mg)a攻毒2952c2952+mtyse血12.23±1.1624.21±0.72ab11.39±4.47肝6.6±0.59.61±1.35a10.36±0.05a脾0.07±0.119.21±4.99ab0.21±0.15 a注：縱列 “a”表示與陰性對(duì)照比較差異極顯著（p0.01）；“b”表示與陽(yáng)性對(duì)照比較差異顯著（p0.01）；小寫(xiě)為差異顯著。2.

30、5.2白介素2對(duì)鼠免疫功能的影響表4 小鼠人工感染大腸桿菌治療前后的 il-2量的變化(ng/mg)a陽(yáng)性對(duì)照組攻毒治療組血1.4±0.41.37±0.381.73±0.79肝2.26±0.022.58±0.031.28±0.40ab脾0.84±0.130.95±0.171.38±0.26a 注：縱列 “a”表示與陰性對(duì)照比較差異極顯著（p0.01）；“b”表示與陽(yáng)性對(duì)照比較差異顯著（p0.01）；小寫(xiě)為差異顯著。小鼠經(jīng)人工感染耐藥大腸桿菌后，血液中il-2的水平變化不明顯，肝中陽(yáng)性對(duì)照組高于健康組，治療

31、后極顯著下降，脾中il-2的水平極顯著高于治療組和健康組，說(shuō)明感染耐藥大腸桿菌后極顯著增加肝、脾的水平。經(jīng)過(guò)治療后，肝內(nèi)水平下降，脾內(nèi)水平持續(xù)走高。2.5.3 白介素6對(duì)鼠免疫功能的影響表5 小鼠人工感染大腸桿菌治療前后的血液中il-6量的變化(ng/mg)健康組攻毒治療組陽(yáng)性對(duì)照組105.7±96.352.2±3.72 a50±0 a注：縱列 “a”表示與陰性對(duì)照比較差異極顯著（p0.01）；3討論3.1 討論mtys提取物能夠調(diào)節(jié)機(jī)體免疫力，增進(jìn)食欲，使生化指標(biāo)有一個(gè)很好的檢測(cè)效果，這與許多報(bào)道中中藥可提高機(jī)體的生長(zhǎng)性能相似14。據(jù)報(bào)道，許多中草藥對(duì)病菌和病毒

32、具有抑制和殺滅的作用，而且能雙向調(diào)節(jié)機(jī)體的免疫功能，促進(jìn)免疫器官淋巴細(xì)胞和其它免疫細(xì)胞發(fā)生、分化、成熟、定居和增殖以及產(chǎn)生免疫應(yīng)答，這與中藥的化學(xué)成分有關(guān)15。3.1.1促進(jìn)機(jī)體免疫器官的發(fā)育，提高機(jī)體免疫力中藥能夠發(fā)揮其效力，主要是通過(guò)中藥的活性成分而實(shí)現(xiàn)的，中藥的活性成分較復(fù)雜，包括生物堿、甙類(lèi)、揮發(fā)油、糖類(lèi)、油脂、有機(jī)酸等16。在mtys中的黃芪和茯苓等中的多糖有益成分能夠促進(jìn)小鼠胸腺的發(fā)育，增加其重量，這與安松蘭、王志祥17等的報(bào)道相一致，能夠提高胸腺指數(shù)；能夠提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)生長(zhǎng)。據(jù)報(bào)道，甘草中的甘草酸和茯苓中的茯苓多糖具有非特異性免疫調(diào)節(jié)作用，增強(qiáng)細(xì)胞免疫，增強(qiáng)巨噬細(xì)胞吞噬功能

33、，選擇性地增強(qiáng)輔助性t淋巴細(xì)胞的增殖能力和活性，使iga和igg明顯降低，對(duì)肝功能具有明顯的改善作用18。本試驗(yàn)中陽(yáng)性對(duì)照組iga、igg和igm明顯增高，而經(jīng)過(guò)處理后的試驗(yàn)組iga、igg和igm得到恢復(fù)或接近正常。這充分說(shuō)明mtys能顯著降低iga、igg和gm含量的作用，從而提高機(jī)體非特異性細(xì)胞免疫功能，表現(xiàn)在肝功能的恢復(fù)。邱全瑛等觀察黃柏水煎劑及其主要生物堿-小檗堿對(duì)小鼠免疫功能的影響，結(jié)果表明黃柏可明顯抑制小鼠對(duì)igm的生成，降低腹腔m吞噬中性粒的作用，說(shuō)明黃柏有較強(qiáng)的免疫抑制作用?？傊?，本試驗(yàn)結(jié)果顯示使用mtys能夠明顯提高胸腺指數(shù)，使免疫球蛋白igg、iga、igm在陽(yáng)性對(duì)照組中

34、均顯著升高，經(jīng)治療后基本恢復(fù)正常，表明mtys在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫功能，增強(qiáng)機(jī)體自身免疫能力方面有著重要的意義。由上所述與本試驗(yàn)的結(jié)果相吻合，說(shuō)明mtys能夠保護(hù)肝細(xì)胞膜的結(jié)構(gòu)，促進(jìn)肝糖原合成，調(diào)節(jié)血糖濃度，改善肝功能，對(duì)肝臟具有保護(hù)作用。4結(jié)論4.1加減三黃湯對(duì)多重耐藥性大腸桿菌的抑菌效果較好。4.2中藥mss的使用劑量，以每天每只鼠0.5ml為宜，耐藥性大腸桿菌2952菌株每只鼠的接種量以原液的0.2ml（1.6×109cfu）為宜。4.3加減三黃湯可以提高小鼠體內(nèi)血清及組織細(xì)胞因子il-2含量，從而增加免疫力。4.4加減三黃湯使小鼠體內(nèi)血清中il-6的含量增加，提高機(jī)體免疫應(yīng)答、防御能力。4.5加減三黃湯通過(guò)對(duì)no的變化，調(diào)節(jié)脾的免疫保護(hù)作用較強(qiáng)，對(duì)肝次之。參考文獻(xiàn)1 朱立軍，動(dòng)物大腸桿菌耐藥性的變化趨勢(shì) j. 中國(guó)獸醫(yī)雜志，2001，35（2）：16-18 2 augustusa m, celaya t, husain f, et al.