1、北京師范大學化學學院化學綜合實驗實驗報告課程名稱： 以 -胰凝乳蛋白酶為催化劑在有機溶劑中合成N-保護的亮 -腦啡肽三肽片段實驗時間：_2015.9.232015.10.28_實驗地點：基礎化學實驗中心化學綜合實驗室學生姓名：學號：2013級 2班_張鈺_201311151046_指導老師：_ 邢國文 _ _以 -胰凝乳蛋白酶為催化劑在有機溶劑中合成 N-保護的亮 -腦啡肽三肽片段張鈺北京師范大學化學學院摘要： 推薦一個面向理科高年級本科的化學生物學綜合實驗。以二氯甲烷為溶劑，使用 - 胰凝乳蛋白酶為催化劑合成 N-保護的亮 - 腦啡肽三肽片段。關鍵詞： 綜合實驗 化學生物學 酶促合成 亮 -

2、 腦啡肽 - 胰凝乳蛋白酶一、實驗目的1、 在做實驗的同時開闊視野，了解一些近年來學科交叉研究領域的研究熱點；2、 熟悉一些化學生物學實驗的基本實驗方法與技巧，為今后的進一步科研深造奠定堅實的實驗基礎；3、通過本課程的訓練，有效的提高獨立科研能力和科研創新能力；4、通過四步反應（獨立完成三步）合成N- 保護的亮 - 腦啡肽三肽片段；二、實驗原理本實驗以酪氨酸（ Tyr ）、雙甘肽（ Gly-Gly ）為起始原料，經過四步反應得到了 N-保護的亮 - 腦啡肽前三肽 Z-Tyr-Gly-Gly-OEt 。1、酪氨酸在氯化亞砜的作用下酯化，得到酪氨酸乙酯鹽酸鹽（HCl Tyr-OEt ）；2、酪氨酸

3、乙酯與芐氧羰酰氯（Z-Cl ）在堿性條件下反應，得到芐氧羰酰酪氨酸乙酯（ Z-Tyr-OEt ）；3、Gly-Gly 在氯化亞砜作用下酯化，得到甘胺酰甘氨酸乙酯鹽酸鹽（ HClGly-GLy-OEt ）；4、Z-Tyr-OEt 與 Gly-GLy-OEt 在二氯甲烷中以 - 胰乳蛋白酶催化得到亮 - 腦啡肽的前三肽，即 N-保護的芐氧羰酰酪氨酰甘 胺酰甘氨酸乙酯（ Z-Tyr-Gly-GLy-OEt ）。三、實驗藥品分子mp/bp/ 溶解性藥品名形狀nDd量CC乙乙水醇醚乙醇無色液體461.3610.79-117.78.5易易易43溶溶溶氯化亞砜淡黃色發煙118.91.64-10578.8分易

4、易液體6解溶溶白色葉狀結132.1Gly-Gly晶或片狀晶262溶難不2體，有光澤Tyr白色結晶粉181.21.456342難不不末0乙醚無色透明液74.121.350.7134-116.34.6微溶溶體3HCl-Tyr-OEt白色結晶245.7溶溶溶HClGly-GLy-O白色結晶196.6溶溶溶Et乙酸乙酯無色液體88.111.3710.902-83.677.2溶溶溶9碳酸氫鉀白色晶體100.1溶不不2苯甲醇無色液體108.11.5391.0419-15.3205.7溶易易36無色有刺激分芐氧羰酰氯性氣味的液170.5溶溶解體硫酸鎂白色粉末1202.66112.4溶微不石油醚無色透明液0.

5、64 40不溶溶體0.6680Z-Tyr-OEt白色晶體343Z-Tyr-Gly-Gly-白色晶體449.1OEt無色油狀液101.11.401-114.三乙胺體，有強烈0.72689.5微溶溶908氨臭丙酮無色液體58.080.7841.3588-94.756.05溶溶溶5四、實驗步驟（1）、HClGly-Gly-OEt的合成、取 8Ml 無水乙醇，用冰鹽浴冷至-10 ，緩慢加入 2Ml 氯化亞砜，加完后繼續攪拌 20min。、加入 Gly-Gly1.0g ，先初步搖勻，放入磁子，用磁力攪拌器室溫攪拌3 天。、用旋轉蒸發儀減壓除去溶劑得到白色固體。、用乙醇 - 乙醚重結晶：先用 3mL乙醇微

6、熱，將固體溶解；在逐步加入乙醚，剛開始一段時間沒有晶體析出，用玻璃棒摩擦瓶壁，很快析出大量白色結晶。、抽濾。烘干并稱重，記錄質量 m1=1.16g。（ 2）、Z-Tyr-OEt 的合成：、將 HClTyr-OEt 0.8g 懸浮于 16mL乙酸乙酯中，加入 KHCO32g 的 13mL水溶液，冰浴下快速攪拌， 15min 內滴加 Z-Cl 的苯甲醇溶液 0.7Ml 。、加完后攪拌 20min，撤去冰浴，室溫再攪拌 2-3h 。、反應結束后用4mol/L 的鹽酸酸化，使水相的pH為 1，分出有機相，用水、飽和食鹽水洗滌，硫酸鎂干燥。、減壓蒸除溶劑后，得到黃色油狀物，置于冰水中，緩慢結晶，過濾得第

7、一批晶體；在母液中加入緩慢加入石油醚再結晶得第二批晶體，共得產物稱重，記錄質量m2=0.64g。（ 3）、以 - 胰凝乳蛋白酶合成 Z-Tyr-Gly-Gly-OEt 。、取 0.425gZ-Tyr-OEt與 HClGly-GLy-OEt0.25g 懸浮于 12.5mL 二氯甲烷中，加入三乙胺 350uL 并在攪拌使底物完全溶解；、調節 pH 值約為 10，反應液為均一透明溶液；、加入 - 胰凝乳蛋白酶 5mg和用注射器加入 50uL 水。室溫下攪拌反應1-2天，反應液中有白色沉淀產生。、反應 3 天后，測反應后體系的pH，將反應液過濾，濾餅依次用二氯甲烷、1mol/L 鹽酸、去離子水洗滌。在

8、紅外燈下烘干產物，稱重記錄質量m3=0.2g。五、實驗數據記錄和處理（ 1） HClGly-Gly-OEt 的產率：m1=1.16gM理論 = 1.2gw=m1/ M理論 100%=96.7%;（ 2） Z-Tyr-OEt 的產率：m2=0.64gM理論 =0.8gw=m/ M理論 100%=80%,產物顏色偏黃，可能有副產物生成，或者是洗滌不夠充分，所以測量產率偏高（ 3） Z-Tyr-Gly-Gly-OEt 的產率：m3=0.2gM理論 =0.625gw=m/ M理論 100%=32%產率低，并且產物不能溶于丙酮。 可能所得產物不是目標產物，而是副產物或者是反應物。原因分析：、反應物為上一

9、次實驗所得的產物，可能含有雜質，影響到此次的實驗；、操作過程中，水的滴加速度過快，且沒有控制好用量，加得過多，而水的含量過多會使酶的活性降低；六、實驗思考與討論1、 冰鹽浴：冰鹽浴的降溫原理與溶液的凝固點下降有關。當食鹽和冰均勻地混合在一起時，冰因吸收環境熱量稍有融化變成水，食鹽遇水而溶解，使表面水形成了濃鹽溶液。由于濃鹽溶液的冰點較純水低，而此時體系中為濃鹽溶液和冰共存，因此體系的溫度必須下降才能維持這一共存狀態（濃鹽溶液和冰的共存溫度應該比純水的冰點更低） 。這將導致更多的冰融化變成水來稀釋濃鹽溶液，在融化過程中因大量吸熱而使體系溫度降低。一般能降到 -20 。2、氯化亞砜：遇水遇熱易分解

10、：SOCl2+2HO=H20+SO2+2HCl在 HCl Gly-GLy-OEt 、 HCl Tyr-OEt 合成中的作用：A. 作為氯化劑；B. 使成酯反應更易進行，與一般酯化不同的是，在氯化亞砜的作用下，酯基中的兩個氧原子都來自于羧基。3、 雙溶劑重結晶的適用條件及操作混合溶劑重結晶：原理：某種有機物在某溶劑中溶解度很好時，先用最少量的該溶劑加熱溶解，再加入溶解度稍差的另一種溶劑，降低該有機物的溶解度，然后降溫析出晶體。混合溶劑重結晶步驟：、按照選擇溶劑的方法，試出混合溶劑各自量的比例、將被重結晶物質加熱溶解于適量的易溶溶劑中、趁熱過濾，以除去不溶性雜質、用滴管逐滴加入熱的不易溶的溶劑，直

11、至出現渾濁，且不再消失為止、再加熱使其澄清，若不澄清，可再加較少量的易溶溶劑，使其剛好澄清、將此熱溶液在室溫下放置，冷卻析出晶體本實驗中C2、 C3、 C5 提純均用到雙溶劑法（又稱反溶劑法）重結晶，即先將待提純物質溶于少量良溶劑（產品在溶劑中溶解性很好） ，可適當加熱，并及時濾去不溶性雜質，確保溶液澄清透明。然后將大量不良溶劑（產品溶解性較差）注入到溶液中等待結晶。注意事項：若局部結晶過快導致晶型不佳，可沿瓶壁緩慢滴入，且勿震蕩過猛；：若晶體不敏感，則注入適量不良溶劑再震蕩即可，也可以加晶種誘導結晶。：注意良溶劑與不良溶劑需互溶。4、影響有機溶劑中酶促反應的因素：酶在各種有機溶劑體系中表現出來的催化性質( 包括酶的活性、穩定性及專一性) 相差甚遠 , 主要取決于反應體系中水的含量和所選用的溶劑。（1）、溶劑的影響： 溶劑對酶的影響體現在其對酶的蛋白質結構、分子柔性以及活性中心的作用。 - 胰凝乳蛋白