1、.第五章 分子生物學研究方法本章主要內容：1、重組DNA技術概念及操作步驟2、工具酶與載體3、DNA操作技術（轉化、陽性克隆的篩選、cDNA文庫的構建、PCR等）4、基因克隆技術5、基因表達技術6、蛋白質表達技術一、 重組DNA技術發展史從1909年丹麥遺傳學家W.Johannsen開始將孟德爾的遺傳因子命名為基因到現在出現的克隆羊“多莉”，分子生物學的發展出現了劃時代的突破和歷史性變革，它已成為生命科學的領頭學科。以分子生物學為理論基礎，以重組DNA技術為主導的生物技術已日益滲透入農林牧副漁、醫藥、食品、石油、化工等應用領域，正在取得不可估量的經濟和社會效益。讓我們回顧一下分子生物學發展史上

2、的重大事件，這樣會使我們更加理解重組DNA技術的誕生是歷史發展的必然結果。（一）重組DNA技術誕生的理論基礎隨著分子生物學的發展，許多生命的基本現象實質和遺傳的奧秘逐漸被揭開神秘的面紗。分子生物學發展史上的三方面成就為重組DNA技術的誕生奠定了堅實的理論基礎。1、年代明確了遺傳的物質基礎是DNA1994年O.Avery及其同事們用光滑型（S）和粗糙型（R）兩種肺炎球菌的菌株做實驗。他們從S型菌的培養物中提取DNA，將其在試管內與R型菌混合，再接種到培養基里，所長出的部分菌落變成了S型，這樣的現象稱為“轉化”。他們發現，加入各種蛋白水解酶，對轉化無影響；但加入少量提純的脫氧核糖核酸酶（DNase

3、）后，轉化很快消失，說明引起細菌遺傳性狀改變的物質是DNA，而不是蛋白質，從而證實了遺傳物質是DNA。2、 50年代揭示了DNA分子的雙螺旋結構模型和半保留復制，解決了基因的自我復制和遺傳信息傳遞問題在DNA的雙螺旋結構建立之前，E.Chargaff已從不同生物來源的DNA中分離出四種堿基，即腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）和胸腺嘧啶（T）。他們發現腺嘌呤的量總是和胸腺嘧啶一樣（A=T），而鳥嘌呤的量也總是和胞嘧啶一樣（G=C），并稱之為堿基配對。而（A+T）/（G+C）的比值隨不同來源的DNA而有所不同。另外M.Wilkins等已對DNA進行X衍射研究，闡明了有關結構、螺旋性質、線形

4、分子直徑、相鄰堿基之間的距離等情況。1953年J.D.Watson和F.H.Crick將E.Chargaff關于DNA堿基組成規律與M.Wilkins等通過X衍射獲得的DNA結構資料結合起來，綜合分析，提出了DNA雙螺旋結構模型。Watson和Crick提出的DNA雙螺旋中兩條鏈的堿基互補的特點，預示了DNA復制是半保留復制，同時還指出遺傳信息儲存在DNA分子堿基序列之中。在1958年，Meselson和Stahl應用重同位素和超速離心的方法證實了DNA的半保留復制。3、 50年代末和60年代提出了“中心法則”和操縱子學說，并成功地破譯了遺傳密碼，從而闡明了遺傳信息的流向和表達問題1958年C

5、rick在DNA雙螺旋學說基礎上提出了分子生物學的“中心法則”，即通過DNA的自我復制，生物體的遺傳信息由父代傳給子代，通過轉錄，遺傳信息傳給RNA，再通過翻譯傳給蛋白質，從而決定了生物的表型，這是生物學最基本的規律。從1961年Nirengerg用人工合成mRNA破譯出第一個遺傳密碼到1969年Crick-Nirenberg確定了全部遺傳密碼，人們了解了大多數生物遺傳信息表達的規律。從遺傳密碼表中我們可以看到mRNA中每3個核苷酸組成一個密碼子，體現一個氨基酸的信息。在64個密碼子中,其中61個分別代表各種氨基酸，剩余的3個密碼子(UAA、UAG、UGA)為肽鏈的終止信號，不代表任何氨基酸（

6、1986年報道UGA代表selenocysteine(硒代半胱氨酸)，2002年UAG可能是編碼第22種氨基酸pyrrolysine的密碼子）。AUG不僅代表蛋氨酸（高等動物），位于mRNA啟動部位的AUG還是肽鏈合成的啟動信號，這套密碼從細菌到人都可通用。“中心法則”發現后，科學家又發現了違反“中心法則”的現象。如1970年Temin和Baltimore在研究只有RNA而無DNA的病毒時，發現了反轉錄酶，該酶能以RNA為模板合成DNA。Temin闡明了反轉錄現象的機制，“中心法則”的內容得到了擴充。Watson和Crick使經典遺傳學的研究達到了現代的分子水平。DNA的自我半保留復制解釋了遺

7、傳性狀代代相傳的穩定性；DNA上一個堿基突變，使三聯密碼改變，可導致多肽鏈上氨基酸改變，進而可導致蛋白質生理功能的改變，這樣就解開了基因突變之謎，從分子水平上闡明了經典遺傳學“變異”的本質，“中心法則”奠定了在分子水平上研究生命現象的理論基礎。Watson和Crick的理論是分子生物學發展史上的重要里程碑，它使人們了解基因指導和編碼蛋白質的一級結構（結構基因），但不了解還存在具備其他功能的基因，故它只是揭開了生命基本現象的一部分本質，而不是全部。揭開生命基本現象另一部分本質的是Jacob和Monod。1961年Jacob和Monod提出了操縱子學說，用基因表達調控的原理解釋了酶誘導的本質，人們

8、才知道還有一類專門起調節和控制蛋白質合成的基因，如調節基因。人們認識到，結構基因只提供編碼某種蛋白質一級結構（氨基酸排列順序）的潛在可能性，而它能否真正編碼并生成某種特定蛋白質，則受調節基因的控制。細菌內外環境因素又決定了調節基因如何發揮作用。由此人們形成了基因調控和表達的概念。總之，“中心法則”和操縱子學說兩者相輔相成地從分子水平上揭開了DNA的復制、轉錄、翻譯、突變和調控表達的奧秘，使人們對生命現象的認識深化了一步。以上所有理論為重組DNA技術的誕生奠定了理論基礎。（二）關鍵性實驗技術問世為重組DNA技術奠基到60年代，重組DNA技術的理論基礎已經具備，但人們還無法自如地得到基因，更無法隨

9、心所欲地移動和改造基因，要真正實施它，還有一些實驗技術問題有待研究解決。眾所周知，生物尤其是真核生物的染色體DNA數量之大，結構之復雜，研究之困難，令人生畏。例如人類遺傳信息貯存在約30億堿基的直線序列中，估計有33.5萬個基因，這些基因決定著人體的構成和活動。人們必須具有分離和富集單基因的技術實力，才能在體外對它的結構與功能等有關問題作深入研究。直到70年代中期，幾項關鍵性實驗技術問世，才誕生了體外DNA重組技術，才有可能做DNA結構分析等研究。1、 DNA分子的切割與連接技術限制性核酸內切酶和連接酶的陸續發現，才使分子生物學家有了進行DNA操作的基本工具，因而它們的重要性是不言而喻的。19

10、70年Smith發現第一個型限制性核酸內切酶HinfI可對DNA分子進行體外切割。1972年H.Boyer首先發現了限制性核酸內切酶EcoRI，以后又不斷發現新的限制性核酸內切酶。截止到1986年，已分離出600多種型限制性核酸內切酶，每種酶都有自己獨特的堿基識別序列，這樣就使分子生物學家對DNA的剪切變得隨意多了。體外對DNA剪切還要連接起來，就要靠連接酶了。1967年世界上5個實驗室幾乎同時發現了DNA連接酶，1970年Khorana又發現了T4 DNA連接酶，它具有更高的連接活性，現廣泛應用于DNA操作中。1972年美國斯坦福大學P.Berg博士領導的研究小組用限制性核酸內切酶EcoRI

11、在體外對猿猴病毒SV40的DNA和噬菌體的DNA分別進行酶切消化，然后用T4 DNA連接酶將兩種消化片段連接起來，結果獲得了包括SV40和噬菌體DNA的重組雜種DNA分子，率先完成了世界上第一次成功的DNA體外重組實驗，并因此與W.Gilbert、F.Sanger分享了1980年度的諾貝爾化學獎。2、載體構建和大腸桿菌轉化體系的建立在體外得到異源重組DNA片段只是第一步，因為大多數的DNA片段無自我復制能力，它必須回到宿主細胞中進行繁殖，這就需要有一種載體（克隆載體）來充當這樣的角色。現在噬菌體、質粒和病毒已被改建成克隆載體。1970年M.Mandel和A.Hige發現，大腸桿菌的細胞經過氯化

12、鈣適當處理之后，便能吸收噬菌體的DNA。1972年美國斯坦福大學S.Cohen報道，經氯化鈣處理的大腸桿菌細胞也能攝取質粒DNA。大腸桿菌轉化體系的建立，對重組DNA技術的創立具有特別重要的意義，因早期使用的克隆載體都是在大腸桿菌中增殖的復制子。1973年S.Cohen等人在質粒研究中做出了開創性工作，他們將編碼卡那霉素抗性基因的大腸桿菌R6-5質粒DNA和編碼四環素抗性基因的另一種大腸桿菌質粒pSC101 DNA混合后，加入限制性核酸內切酶EcoRI對DNA進行酶切，然后用T4 DNA連接酶將它們連接成重組的DNA分子，最后用其轉化大腸桿菌，結果發現，某些轉化菌落表現出既抗卡那霉素又抗四環素

13、的雙重抗性特性。從這種雙抗性轉化菌落的大腸桿菌細胞中分離出來的重組質粒DNA帶有完整的pSC101分子和一個來自R6-5質粒編碼卡那霉素抗性基因的DNA片段。人們進一步要問：不同物種的外源DNA片段是否也能在大腸桿菌細胞中增殖呢？S.Cohen等人的進一步實驗回答了這個問題。他們把非洲爪蟾的編碼核糖體基因的DNA片段同pSC101質粒重組，并導入大腸桿菌細胞。結果表明：非洲爪蟾的基因進入大腸桿菌細胞，并轉錄出相應的mRNA產物。S.Cohen等的工作是世界上第一次成功的基因克隆實驗，創立了體外重組DNA技術的模式。它說明像pSC101這樣的質粒分子可作為基因克隆的載體將外源DNA導入宿主細胞，

14、也說明像非洲爪蟾這樣的真核動物的基因可成功地被轉移到原核細胞中并實現其功能表達，這預示著人類將遺傳性狀定向改造，創造出具有優良性狀新物種的理想的實現已為期不遠了。3、 Southern雜交、DNA序列分析和聚合酶鏈反應1975年Southern發明了Southern印跡雜交技術，他先用限制性核酸內切酶對DNA分子進行酶切，然后經瓊脂糖凝膠電泳將所得DNA片段按分子量大小分離，再將DNA片段的瓊脂糖凝膠變性，并將其中的單鏈DNA片段轉移到硝酸纖維素膜或其他固相支持物上。這種濾膜可用于下一步的雜交反應。雜交雙方是待測核酸序列和用于檢測的已知核酸片段的探針。由于核酸分子雜交的高度特異性及檢測方法的高

15、度靈敏性，它已被廣泛應用于基因克隆的篩選、酶切圖譜制作、基因組中特定基因序列的定性、定量檢測和疾病診斷等方面，它的應用大大推進了分子生物學的發展。1977年Sanger在總結了1953年加減法測序基礎上，創造了雙脫氧鏈末端終止法，可在放射自顯影的圖譜上直接讀出DNA的順序，使人類基因組結構快速分析成為可能。1985年K.B.Mullis建立了聚合酶鏈反應（PCR）并于1987年獲得專利。PCR是近年發展起來的一種體外擴增特異DNA片段的技術。人們為了獲得某一特定DNA進行研究，按傳統方法，要經過DNA酶切、連接、導入菌體進行擴增、篩選等過程，耗時數周到數月，而PCR技術可在數小時內將僅有幾個拷

16、貝的基因放大百萬倍，大大簡化了傳統的體外重組DNA技術，從而使人們可較容易地對目的基因進行分析、鑒定。故PCR技術雖問世時間不長，但迅速滲透到生物學、醫學、法醫學、考古學等許多領域，得到了廣泛應用。Southern雜交、DNA序列分析和PCR等技術的相繼涌現，使重組DNA技術發展日新月異，逐步完善。21世紀是“生物學世紀”，生命科學已成為科學的前沿，而分子生物學又是生命科學的帶頭學科，它的理論和技術導致眾多學科向分子水平發展，生物工程高技術產業也隨之誕生并得到迅速發展，它正在國民經濟發展中發揮越來越重要的作用。（三）重組DNA技術的概念重組DNA技術(recombinant DNA techn

17、ique): 是按照人們意愿，在體外對DNA分子進行重組，再將重組分子導入受體細胞，使其在細胞中擴增和繁殖，以獲得該DNA的大量拷貝。所謂克隆(clone)是指通過無性繁殖過程的產生的與親代完全相同的子代群體。由于實驗是對基因操作(gene manipulation)，故又稱為基因克隆(gene cloning)；又由于這類克隆是在分子水平上操作的，又稱為分子克隆(molecular cloning)。它之所以有這么多的名稱，是由于重組DNA技術從誕生到現在僅僅30年的歷史，所使用的名詞術語還未來得及統一的緣故。人們混用這些名稱，從某種意義上講，只不過是各自強調的側重點有所不同而已。（四）重組

18、DNA技術的基本步驟1、重組DNA技術的四大要素外源基因；載體；工具酶；受體細胞。2、重組DNA技術的基本步驟目的基因的獲得與載體的制備目的基因與載體DNA的連接重組DNA分子導入受體細胞重組體的篩選與重組DNA的鑒定克隆基因的表達及表達產物的檢測與分離純化（五）重組DNA技術的意義重組DNA技術從誕生之日到現在僅僅三十年間已有了飛躍發展，它已涉及農林牧副漁、醫藥、環境監測與凈化、食品、石油、化工等國民經濟的諸多應用領域。它已給人類社會帶來難以估量的社會效益和經濟效益，有著廣闊的應用前景。在本門課的緒論部分已經介紹了其應用概況，這里只重點講一下它的理論意義。重組DNA技術填平了生物種屬間不可逾

19、越的鴻溝根據傳統的遺傳學規律，人們深信“種瓜得瓜，種豆得豆”是天經地義的事情，但跨越天然物種屏障，將原核生物和真核生物、植物和動物、細菌和人、動物和人的基因連接起來，進行基因交流，形成雜種生物，造福人類，這在過去，人們是難以想象，也是難以置信的，現在已成為現實。重組DNA技術縮短了進化時間遺傳和變異是一對矛盾，遺傳賦予生物種的穩定，變異賦予生物種的進化。在漫漫歷史長河中，自然變異的進化時間千萬年，常規育種亦要幾年，而重組DNA技術將進化時間大大縮短至幾年。近年來已興起闡明作物遺傳信息序列和繪制基因圖譜的熱潮，我國也正在繪制水稻基因圖。我們相信，基因操作用于育種，將縮短進化時間，在解決全世界人民

20、溫飽問題上將發揮重要作用。重組DNA技術使人能對生物進行定向改造自然變異是不以人的意志為轉移的隨機過程，而重組DNA技術革命標志著人類控制和改造生物的歷史已進入了一個新紀元。以重組DNA技術培育出抗真菌蔬菜為例，幾丁質是真菌細菌壁的組分之一，幾丁質酶能水解幾丁質，美國科學家將幾丁質酶基因導入西紅柿、馬鈴薯、和甜菜中，正準備大田試驗，這一技術將對蔬菜抗真菌感染具有重要意義。另外應用重組DNA技術可以在體外大量擴增、純化人們感興趣的基因，研究其結構、功能及調控機制，從而拓寬了分子生物學的研究領域，這對醫學上遺傳性疾病、腫瘤、肥胖、心血管疾病等病因的查明、診斷及治療具有重大意義。（六）重組DNA實驗

21、中常見的主要工具酶酶類功能限制性核酸內切酶識別并在特定位點切開DNADNA連接酶通過磷酸二酯鍵把兩個或多個DNA片段連接成一個DNA分子DNA聚合酶按5到3方向加入新的核苷酸，補平DNA雙鏈中的缺口反轉錄酶按照RNA分子中的堿基序列，根據堿基互補原則合成DNA鏈多核苷酸激酶把磷酸基團加到多聚核苷酸鏈的5-OH末端末端轉移酶在雙鏈核酸的3末端加上多聚單核苷酸DNA外切酶從DNA鏈的3末端逐個切除單核苷酸噬菌體DNA外切酶從DNA鏈的5末端逐個切除單核苷酸堿性磷酸酯酶切除位于DNA鏈5或3末端的磷酸基團限制性核酸內切酶和連接酶是基因工程關鍵的工具酶，由于這兩種酶的發現和分離純化，使體外基因重組得以

22、實現。限制性核酸內切酶用于有規律地切割DNA，把提供的DNA原材料切割成具有特定末端的DNA片段。現已有從不同生物中發現和分離出上千種限制性核酸內切酶，基本上可滿足按不同目的切割各種DNA分子的需要。根據限制性核酸內切酶識別序列的規律性，還有一些能識別某些識別序列的限制性核酸內切酶沒有被發現，今后隨著研究的深入將會逐步填補這些空白。此外，耐熱性限制性核酸內切酶和長識別序列稀有內切酶仍然是當前研究的熱門課題。DNA連接酶用于連接各種DNA片段，使不同基因重組。現在常用的DNA連接酶只有兩種，即大腸桿菌DNA連接酶和T4 DNA連接酶，前者只能連接粘性末端的DNA片段；后者既能連接具有粘性末端的DNA片段，也能連接具有平末端的DNA片段。是否還有更好的DNA連接酶，有待進一步研究。DNA聚合酶用于人工合成引物等DNA小片段以及含基因的較大DNA片段，還用于制備DNA探針。多種耐熱性DNA聚合酶的發現，使PCR技術迅速發展，給當今生命科學很多學科提供了先進的研究手段。用于PCR的耐熱性DNA聚合酶有Taq DNA聚合酶、Tth DNA聚合酶、Bst DNA聚合酶、Pwo DNA聚合酶