1、分子生物學研究法第六章第六章 分子生物學研究法（下） 聚合酶鏈反應（聚合酶鏈反應（Polymerase chain reaction，PCR）是一種體外擴增）是一種體外擴增DNA片段的方法，與用片段的方法，與用載體和宿主細胞的體內擴增相比，有簡便、快速載體和宿主細胞的體內擴增相比，有簡便、快速的優點，并有許多特殊的用處。的優點，并有許多特殊的用處。 PCR的特點的特點一、一、 PCR聚合酶鏈反應聚合酶鏈反應分子生物學研究法PCR的基本原理一分子生物學研究法PCR的基本原理二分子生物學研究法PCR的基的基本原理本原理PCR Flash分子生物學研究法PCR反應的體系DNA模板模板一對引物一對引物

2、耐熱的耐熱的DNA聚合酶聚合酶4dNTP緩沖液緩沖液Mg2+、K+離子離子酶活性保護劑酶活性保護劑分子生物學研究法PCR儀 PCR儀實際上就是一種溫度循環儀，它儀實際上就是一種溫度循環儀，它能夠快速地升降溫和保持恒溫，全部由電腦能夠快速地升降溫和保持恒溫，全部由電腦控制。常用的反應容器有控制。常用的反應容器有0.2ml的薄壁的薄壁Eppendorf管和毛細玻璃管。管和毛細玻璃管。 分子生物學研究法對DNA模板的要求 對對DNA模板純度的要求不很高，但必須除去模板純度的要求不很高，但必須除去DNA聚合酶抑制劑。理論上有一個聚合酶抑制劑。理論上有一個DNA模板分子就模板分子就可以擴增出大量的產物，

3、實際上使用可以擴增出大量的產物，實際上使用pgng級的模板級的模板量。模板一般是雙鏈分子，也可以是單鏈分子。模量。模板一般是雙鏈分子，也可以是單鏈分子。模板板DNA分子不宜太長，可用切點稀少的限制酶切成分子不宜太長，可用切點稀少的限制酶切成較短的片段。由于環狀較短的片段。由于環狀DNA模板的擴增效率較線狀模板的擴增效率較線狀DNA模板低，所以最好先將環狀模板低，所以最好先將環狀DNA用限制酶切成用限制酶切成線狀再行擴增。線狀再行擴增。 RNA模板應先逆轉錄成模板應先逆轉錄成cDNA再進行再進行PCR擴增。擴增。分子生物學研究法引 物長度一般為長度一般為1530個核苷酸。引物太短與模個核苷酸。引

4、物太短與模板結合的位點特異性差，引物太長與模板結板結合的位點特異性差，引物太長與模板結合的速率下降，影響合的速率下降，影響PCR的效率。的效率。不應有超過不應有超過3個連續的個連續的C或或G。引物自身不存。引物自身不存在互補序列，兩個引物之間也不能有超過在互補序列，兩個引物之間也不能有超過4個連續堿基互補的情況。個連續堿基互補的情況。當引物的當引物的3端有足夠長與模板互補的序列時，端有足夠長與模板互補的序列時，引物的引物的5端可以不與模板互補，利用這點可端可以不與模板互補，利用這點可在在PCR產物的兩端加上特殊序列（如限制性產物的兩端加上特殊序列（如限制性內切酶位點）。內切酶位點）。分子生物學

5、研究法引物引物5端外加端外加BamH酶切酶切 位點摻入產物的兩端位點摻入產物的兩端分子生物學研究法引 物為了方便為了方便PCR產物的檢測和分析，可以在引產物的檢測和分析，可以在引物的物的5端以同位素或非同位素修飾（端以同位素或非同位素修飾（32P、熒、熒光素、生物素等）。光素、生物素等）。當要擴增的當要擴增的DNA序列不知，但知其編碼的氨序列不知，但知其編碼的氨基酸序列，可反推出基酸序列，可反推出DNA序列，為設計引物序列，為設計引物提供依據。因簡并密碼的存在，反推出的提供依據。因簡并密碼的存在，反推出的DNA序列是不唯一的，這時應采用簡并引物。序列是不唯一的，這時應采用簡并引物。分子生物學研

6、究法引物引物 5 5 端修飾技術端修飾技術修飾法修飾法用途用途修飾法修飾法用途用途1.附加核酸序列附加核酸序列2.功能基因修飾功能基因修飾酶切位點酶切位點便于克隆等便于克隆等同位素同位素(35S, 32P)檢測，定量檢測，定量噬菌體啟動子噬菌體啟動子測序，合成測序，合成RNA探針等探針等生物素生物素檢測，純化，定量檢測，純化，定量蛋白質結合序列蛋白質結合序列產物純化，檢測產物純化，檢測熒光素熒光素檢測，純化檢測，純化酶酶檢測檢測分子生物學研究法Taq DNA聚合酶 現在常用的現在常用的Taq酶，在酶，在95的變性溫度下的變性溫度下（20秒），經過秒），經過50次循環仍保持次循環仍保持65 %的

7、酶活性。的酶活性。對于對于Taq酶的聚合酶活性來說，最佳作用溫度為酶的聚合酶活性來說，最佳作用溫度為7580，60時聚合酶活性僅剩時聚合酶活性僅剩1/2，37時時聚合酶活性僅剩聚合酶活性僅剩1/10。但在許多情況下，需要。但在許多情況下，需要在低于最適溫度條件下進行聚合反應，以免引在低于最適溫度條件下進行聚合反應，以免引物從模板上解離下來。物從模板上解離下來。 分子生物學研究法Taq DNA聚合酶 Taq酶有酶有53的聚合活性和的聚合活性和53的外切活性，的外切活性，但缺少但缺少35的外切活性，所以沒有校正功能，有的外切活性，所以沒有校正功能，有時會發生錯誤合成。使用時會發生錯誤合成。使用Ta

8、q酶還往往在所有擴增酶還往往在所有擴增產物的產物的3端增加一個非模板依賴的端增加一個非模板依賴的A。現在作為商。現在作為商品供應的品供應的Taq酶有從嗜熱水生菌中提純的天然酶和酶有從嗜熱水生菌中提純的天然酶和利用大腸桿菌生產的基因工程酶。利用大腸桿菌生產的基因工程酶。 分子生物學研究法PCR的反應體系 PCR中常用的緩沖液是中常用的緩沖液是1050 mmol / L的的Tris-HCl緩沖液，緩沖液，pH8.38.9，還需要合適的，還需要合適的Mg2+濃度（約濃度（約1.5 mmol / L）和）和K+濃度（濃度（50 mmol / L），），其中其中Mg2+濃度須經過預備實驗確定合適的值，在

9、濃度須經過預備實驗確定合適的值，在0.05 mmol / L和和5 mmol / L之間試驗，按每之間試驗，按每0.5 mmol / L增加。增加。Mg2+濃度太高時非特異擴增增加，濃度太高時非特異擴增增加，太低時產物減少。太低時產物減少。 分子生物學研究法PCR的反應體系 Taq酶的用量必須適當，一般典型的擴增反應酶的用量必須適當，一般典型的擴增反應加加2單位的酶，太高非特異擴增增加，太低時擴增單位的酶，太高非特異擴增增加，太低時擴增效率下降。效率下降。4種種dNTP的濃度應相等，濃度在的濃度應相等，濃度在20200mol/L之間。反應體系中加入之間。反應體系中加入BSA或明膠可以或明膠可以

10、保護保護Taq酶活性。在無熱蓋的酶活性。在無熱蓋的PCR儀上，反應液表儀上，反應液表面應加礦物油以阻止蒸發。面應加礦物油以阻止蒸發。 分子生物學研究法循環條件的設定變性變性-退火退火-鏈延伸鏈延伸循環循環變性變性退火退火鏈延伸鏈延伸首輪循環首輪循環94 5 min50 2 min72 3 min中間循環中間循環94 1 min50 2 min72 3 min末輪循環末輪循環94 1 min50 2 min7210min循環條件舉例循環條件舉例 在循環溫度的設定中，最重要的是退火溫度。在循環溫度的設定中，最重要的是退火溫度。退火溫度較低可提高擴增效率，但產物的特異性較差；退火溫度較低可提高擴增效

11、率，但產物的特異性較差；退火溫度較高可提高產物的特異性，但擴增效率較低。退火溫度較高可提高產物的特異性，但擴增效率較低。分子生物學研究法嵌套PCR( nested PCR)嵌套嵌套PCR主要是為了提主要是為了提高擴增產物的特異性。高擴增產物的特異性。分子生物學研究法嵌套PCR提高產物特異性的原理單用第一對引物擴增，得一特異性產物和可能存在的非特異性產物。單用第一對引物擴增，得一特異性產物和可能存在的非特異性產物。單用第二對引物擴增，得一特異性產物和可能存在的非特異性產物。單用第二對引物擴增，得一特異性產物和可能存在的非特異性產物。以第一對引物擴增的產物為模板，用第二對引物再次擴增，只得到特以第

12、一對引物擴增的產物為模板，用第二對引物再次擴增，只得到特異性產物。異性產物。特異性產物特異性產物特異性產物特異性產物非特異性產物非特異性產物非特異性產物非特異性產物分子生物學研究法反向PCR( inverted PCR)反向反向PCR擴增已知序擴增已知序列兩側的未知序列。列兩側的未知序列。分子生物學研究法錨式PCR( anchored PCR)錨式錨式PCR擴增已知擴增已知序列一側的序列。序列一側的序列。分子生物學研究法錨式PCR擴增已知序列3側序列擴增擴增mRNA3端或端或5端端的序列稱為的序列稱為RACE。Rapid Amplification of cDNA Ends分子生物學研究法錨式

13、PCR擴增已知序列5側序列分子生物學研究法擴增全長的mRNA序列 要擴增全長的要擴增全長的mRNA，先用，先用oligo(dT) 作引物逆轉錄該作引物逆轉錄該mRNA成全長的成全長的cDNA第一第一鏈，再給鏈，再給cDNA第一鏈的第一鏈的3端進行同聚物加端進行同聚物加尾（如尾（如GGGGG），最后用），最后用oligo(dT)和和oligo(dC)進行擴增。進行擴增。 分子生物學研究法不對稱PCR( asymmetric PCR)不對稱不對稱PCR大量擴增模大量擴增模板的一條鏈。板的一條鏈。分子生物學研究法定量PCR 嚴格地掌握實驗條件，使嚴格地掌握實驗條件，使PCR擴增產物量與擴增產物量與模

14、板量成正比。這樣可將不便于直接測定的痕量模板量成正比。這樣可將不便于直接測定的痕量的模板擴增后檢測，按比例得到原模板的量。的模板擴增后檢測，按比例得到原模板的量。 此法常用于低豐度此法常用于低豐度mRNA的檢測。先將的檢測。先將mRNA反轉錄成反轉錄成cDNA，再以，再以cDNA為模板擴增出為模板擴增出產物，檢測產物的量從而推算出低豐度產物，檢測產物的量從而推算出低豐度mRNA的的量。這種方法稱為反轉錄量。這種方法稱為反轉錄PCR（RTPCR）。）。( quantitative PCR )定量定量PCR測定痕量模板的量。測定痕量模板的量。分子生物學研究法定量PCR中的內標 由于影響擴增產量的因

15、素較多，模板與擴增由于影響擴增產量的因素較多，模板與擴增產物量的比例關系難以確定，所以必須在同一次產物量的比例關系難以確定，所以必須在同一次PCR中加入內標。在一次中加入內標。在一次PCR中同時加入兩種模中同時加入兩種模板，一種是待測模板，另一種是按確定量加入的板，一種是待測模板，另一種是按確定量加入的作為內標的對照模板，二者使用相同的引物，對作為內標的對照模板，二者使用相同的引物，對照模板與待測模板的差異應盡量小，以便最大程照模板與待測模板的差異應盡量小，以便最大程度地減少擴增效率的系統誤差。對照模板擴增產度地減少擴增效率的系統誤差。對照模板擴增產物和待測模板擴增產物必須能由電泳分辨出來，物

16、和待測模板擴增產物必須能由電泳分辨出來，比如二者的分子量有一定的差異，或是二者序列比如二者的分子量有一定的差異，或是二者序列中有限制酶切位點的差異。中有限制酶切位點的差異。 分子生物學研究法熒光定量PCR 1995年美國年美國PerKin Elmer公司研制成功具有公司研制成功具有革命性意義的熒光定量革命性意義的熒光定量PCR技術，它融合了技術，它融合了PCR高靈敏性、高靈敏性、DNA雜交的高特異性和光譜技雜交的高特異性和光譜技術的高精確定量等優點。熒光定量術的高精確定量等優點。熒光定量PCR是直接是直接探測探測PCR過程中熒光信號的變化以獲得定量的過程中熒光信號的變化以獲得定量的結果，不需要

17、結果，不需要PCR后處理或電泳檢測，完全閉后處理或電泳檢測，完全閉管操作，在整個過程中，僅有加入樣品的一次開管操作，在整個過程中，僅有加入樣品的一次開蓋。蓋。 分子生物學研究法TaqMan熒光探針（線性探針）（線性探針） 在在PCR擴增體系中加入一個特異性的、能與擴增體系中加入一個特異性的、能與PCR產物中部雜交的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩產物中部雜交的熒光探針，該探針為一寡核苷酸，兩端分別標記一個熒光報告基團（端分別標記一個熒光報告基團（R）和一個熒光淬滅）和一個熒光淬滅基團（基團（Q）。探針完整時，）。探針完整時，R基團發射的熒光信號被基團發射的熒光信號被Q基團吸收，結果是沒有熒光出

18、現。基團吸收，結果是沒有熒光出現。PCR擴增時，擴增時，Taq酶的酶的53外切活性將探針酶切降解，使外切活性將探針酶切降解，使R基基團與團與Q基團分離，基團分離，Q基團對基團對R基團的熒光淬滅作用消基團的熒光淬滅作用消失，于是產生熒光信號。每擴增一條失，于是產生熒光信號。每擴增一條DNA鏈，就有鏈，就有一個一個R基團分離，游離的基團分離，游離的R基團數量（也就是熒光強基團數量（也就是熒光強度）與度）與PCR產物的形成完全同步。通過檢測熒光強度產物的形成完全同步。通過檢測熒光強度的變化，機內的電腦可以計算并直接給出初始模板的的變化，機內的電腦可以計算并直接給出初始模板的數量。數量。 分子生物學研

19、究法TaqMan熒光探針工作原理分子生物學研究法分子信標（環狀探針）（環狀探針） 分子信標熒光探針的設計與分子信標熒光探針的設計與TaqMan熒光探針熒光探針相似，只不過探針的相似，只不過探針的5端和端和3端的一小段序列被端的一小段序列被設計成互補的，探針沒有與靶序列雜交時會形成莖設計成互補的，探針沒有與靶序列雜交時會形成莖環結構，環結構，R基團和基團和Q基團靠近，不能產生熒光。當基團靠近，不能產生熒光。當分子信標與靶序列雜交時，莖環結構被展開，使得分子信標與靶序列雜交時，莖環結構被展開，使得R 基團和基團和Q基團分開基團分開足夠遠，足夠遠，Q基團對基團對R基團的熒光淬滅作基團的熒光淬滅作用消

20、失。余同前。用消失。余同前。分子生物學研究法SYBR熒光染料 在在PCR反應體系中，加入過量的反應體系中，加入過量的SYBR熒熒光染料，光染料，SYBR熒光染料能特異性地摻入熒光染料能特異性地摻入DNA雙鏈中，產生熒光信號，而不摻入雙鏈中，產生熒光信號，而不摻入DNA雙鏈中雙鏈中的的SYBR熒光染料不會發出熒光。這樣熒光強熒光染料不會發出熒光。這樣熒光強度就與雙鏈度就與雙鏈DNA的量成正比。的量成正比。 分子生物學研究法熒光定量PCR儀光路圖分子生物學研究法PCR產物與載體的連接解決辦法：解決辦法：用用T4 DNA聚合酶除去聚合酶除去PCR產物產物3端多余的端多余的核苷酸，成為平端后連接。核苷

21、酸，成為平端后連接。1 給平端載體的兩個給平端載體的兩個3端各加上一個端各加上一個T，使，使其與其與3A突出的突出的PCR產物互補，然后連接。產物互補，然后連接。 Taq DNA聚合酶的擴增產物往往不是平聚合酶的擴增產物往往不是平端，而是在雙鏈端，而是在雙鏈DNA產物的兩個產物的兩個3端再加上端再加上一個非模板來源的核苷酸，一個非模板來源的核苷酸，A的可能最大，這的可能最大，這樣有礙于平端的連接。樣有礙于平端的連接。分子生物學研究法PCR產物與載體的A-T連接分子生物學研究法mRNA差別顯示分子生物學研究法利用PCR的定點突變引物引物1或引物或引物2的的5端有不與模板端有不與模板互補的突變。互

22、補的突變。分子生物學研究法利用PCR的定點突變兩段PCR產物連接處兩段PCR產物連接處分子生物學研究法BIORAD公司的公司的PCR之歌之歌There was a time when to amplify DNA,You had to grow tons and tons of tiny cells.Then along came a guy named Dr. Kary Mullis,Said you can amplify in vitro just as well.Just mix your template with a buffer and some primers,Nucleoti

23、des and polymerases, too.Denaturing, annealing, and extending.Well its amazing what heating and cooling and heating will do.PCR, when you need to detect mutations.PCR, when you need to recombine.PCR, when you need to find out who the daddy is.PCR, when you need to solve a crime. 分子生物學研究法二、二、DNA分子標記技

24、術 DNA分子標記就是在不同生物個體間分子標記就是在不同生物個體間DNA序列上的差異，某一特定的差異可以通過實驗的序列上的差異，某一特定的差異可以通過實驗的方法檢測出來，測出來的特定差異就是特定的方法檢測出來，測出來的特定差異就是特定的DNA分子標記。利用不同的實驗方法可以得到許分子標記。利用不同的實驗方法可以得到許許多多的許多多的DNA分子標記，這些分子標記，這些DNA分子標記表分子標記表明了這些個體間遺傳物質上的差異。明了這些個體間遺傳物質上的差異。 分子生物學研究法遺傳標記的發展形態標記形態標記 細胞學標記（染色體多態性）細胞學標記（染色體多態性） 蛋白質標記（同工酶，分子標記）蛋白質標

25、記（同工酶，分子標記） DNA 標記（分子標記）標記（分子標記）分子生物學研究法RFLP 分析 RFLP（restriction fragment length poly-morphism）稱為限制性片段長度多態性。當用）稱為限制性片段長度多態性。當用某種限制性內切酶處理不同生物個體來源的某種限制性內切酶處理不同生物個體來源的DNA時，由于個體間時，由于個體間DNA序列的差異，所產生的切割序列的差異，所產生的切割片段長度和數量可能不同，利用凝膠電泳可以將片段長度和數量可能不同，利用凝膠電泳可以將這些片段分離并觀察到差異，這種差異就是這些片段分離并觀察到差異，這種差異就是RFLP。分子生物學研究

26、法RFLP 分析 RFLP產生的差異帶可以作為分子標記，用于產生的差異帶可以作為分子標記，用于遺傳學的研究。遺傳學的研究。 當一個生物有多條染色體，且當一個生物有多條染色體，且DNA分子很大分子很大時，用一種限制性內切酶切割出的時，用一種限制性內切酶切割出的DNA片段太多，片段太多，電泳后的條帶無法分辨。電泳后的條帶無法分辨。 使用某一特定序列的標記探針，與電泳分離的使用某一特定序列的標記探針，與電泳分離的片段進行片段進行Southern雜交，再顯示出雜交帶，可以大雜交，再顯示出雜交帶，可以大大減少被觀察條帶的數目，便于不同生物個體間的大減少被觀察條帶的數目，便于不同生物個體間的比較和找出差異

27、帶。比較和找出差異帶。分子生物學研究法RFLP 分析 換不同的限制性內切酶切割，配合不同換不同的限制性內切酶切割，配合不同的標記探針，可以得到數目多得驚人的條帶，的標記探針，可以得到數目多得驚人的條帶，從而找到很多的分子標記。這些分子標記與從而找到很多的分子標記。這些分子標記與表型標記一樣，可以用于遺傳學的研究。但表型標記一樣，可以用于遺傳學的研究。但分子標記沒有顯隱性之分，都是共顯性的。分子標記沒有顯隱性之分，都是共顯性的。分子生物學研究法采用一種探針作 6 個栽培品種的RFLP分析分子生物學研究法RFLP所用探針的來源 RFLP分析的效率依賴于選擇合適的探針。分析的效率依賴于選擇合適的探針

28、。由于用能探測重復序列的探針探測出的片段太由于用能探測重復序列的探針探測出的片段太多，難以比較，所以探針一般來自單拷貝或低多，難以比較，所以探針一般來自單拷貝或低重復序列。常用的重復序列。常用的RFLP探針主要來源于隨機基探針主要來源于隨機基因組克隆和因組克隆和cDNA克隆。克隆。分子生物學研究法RFLP所用探針的來源 由于基因組由于基因組DNA中甲基化一般很少在表達中甲基化一般很少在表達基因中發生，故用對甲基化敏感的限制酶切，基因中發生，故用對甲基化敏感的限制酶切，可得到長度為可得到長度為12kb的的DNA片段，它們是單拷片段，它們是單拷貝或低重復序列，用這些片段制成文庫，即可貝或低重復序列

29、，用這些片段制成文庫，即可用作用作RFLP探針。探針。 如果用如果用cDNA克隆作探針，最好制備來自克隆作探針，最好制備來自生物整體生物整體mRNA的的cDNA文庫。文庫。分子生物學研究法RFLP標記的共顯性分子生物學研究法什么是多態性 多態性是在不同個體之間比較得到多態性是在不同個體之間比較得到的差異帶，來自于一個個體本身的長短的差異帶，來自于一個個體本身的長短不等的片段不是多態性。不等的片段不是多態性。分子生物學研究法RFLP 標記的優點1. RFLP標記無表型效應，不受環境條件和發育階標記無表型效應，不受環境條件和發育階段的影響。因此可在特征性狀遠未出現之前就可段的影響。因此可在特征性狀

30、遠未出現之前就可以知道其基因型。以知道其基因型。2. RFLP標記在等位之間是共顯性的，因此不受雜標記在等位之間是共顯性的，因此不受雜交方式的影響。不管是正交、反交、回交，總是交方式的影響。不管是正交、反交、回交，總是在在F1代中含有兩親本各一組染色體的片段之和。代中含有兩親本各一組染色體的片段之和。3. 用不同探針可以探測出不同的用不同探針可以探測出不同的RFLP標記，標記標記，標記的密度遠遠超過以性狀為基礎的圖譜。的密度遠遠超過以性狀為基礎的圖譜。分子生物學研究法RFLP 的不足 雖然雖然RFLP分子標記有這些優點，但實驗步驟分子標記有這些優點，但實驗步驟較多，費工費時，費用也高，使其應用

31、受到一定較多，費工費時，費用也高，使其應用受到一定的限制。的限制。 要使要使RFLP在指導遺傳育種中在指導遺傳育種中發揮作用，還必發揮作用，還必須將須將RFLP與已知性狀聯系起來，僅有與已知性狀聯系起來，僅有RFLP標記標記圖使用價值不大。圖使用價值不大。分子生物學研究法可變數量串聯重復（VNTRs） 在真核生物基因組中有小衛星和微衛星序列存在真核生物基因組中有小衛星和微衛星序列存在，它們是短序列（核心序列）高度重復的序列，在，它們是短序列（核心序列）高度重復的序列，在不同生物個體間，某一座位上的核心序列重復的在不同生物個體間，某一座位上的核心序列重復的次數有很大差異，并且這些重復序列有多座位

32、性，次數有很大差異，并且這些重復序列有多座位性，因此形成了高度的多態性。用某種高度重復序列的因此形成了高度的多態性。用某種高度重復序列的核心序列作探針，測定其核心序列作探針，測定其RFLP，得到電泳后的雜交，得到電泳后的雜交圖譜，這種圖譜稱為指紋圖譜，可以用來鑒別個體、圖譜，這種圖譜稱為指紋圖譜，可以用來鑒別個體、親子鑒定等。親子鑒定等。分子生物學研究法VNTR一例The cause of the variation between individual genomes at microsatellites or minisatellites is that individual allele

33、s have different numbers of the repeating unit.For example, one minisatellite has a repeat length of 64bp, and is found in the population with the following distribution:7% 18 repeats 11% 16 repeats43% 14 repeats 36% 13 repeats 4% 10 repeats分子生物學研究法VNTR差異帶的檢測分子生物學研究法父母子女間VNTR的檢測結果分子生物學研究法VNTR應用舉例 用用

34、33.15（探針名）進行白種人的（探針名）進行白種人的DNA指紋分指紋分析時，兩個無血緣關系的個體具有相同析時，兩個無血緣關系的個體具有相同DNA指紋指紋圖譜的概率為圖譜的概率為31011，而當把，而當把33.15和和33.6兩個兩個探針取得的結果綜合分析時，兩個個體指紋圖譜探針取得的結果綜合分析時，兩個個體指紋圖譜相同的概率更是降低到相同的概率更是降低到51019。 分子生物學研究法隨機擴增多態DNA（RAPD） RAPD（randomly amplified polymorphic DNA）稱為隨機擴增）稱為隨機擴增DNA多態性。它是利用隨多態性。它是利用隨機引物（通常為機引物（通常為10

35、個核苷酸）對不同生物個體基個核苷酸）對不同生物個體基因組因組DNA進行進行PCR擴增，擴增產物經電泳分離，擴增，擴增產物經電泳分離，溴化乙錠染色，顯示出擴增產物的多態性。不同溴化乙錠染色，顯示出擴增產物的多態性。不同個體間差異的條帶可以作為分子標記。個體間差異的條帶可以作為分子標記。分子生物學研究法RAPD的特點雖然對具體的一個引物而言其檢測雖然對具體的一個引物而言其檢測DNA多態性的位多態性的位點是有限的，但是當采用一組引物時，檢測區域幾乎點是有限的，但是當采用一組引物時，檢測區域幾乎可以覆蓋整個基因組，從而得到整個基因組可以覆蓋整個基因組，從而得到整個基因組DNA的多的多態性。態性。RAP

36、D的特點是操作簡便迅速，不需要標記探針。只的特點是操作簡便迅速，不需要標記探針。只要有一套隨機引物就能對任何物種進行要有一套隨機引物就能對任何物種進行RAPD操作。操作。RAPD標記也必須與表型相聯系才能發揮指導遺傳育標記也必須與表型相聯系才能發揮指導遺傳育種的作用。種的作用。分子生物學研究法MAAP技術比較 DAF AP-PCR RAPD引物長度引物長度( nt ) 515 2034 910引物濃度引物濃度(mmol/L) 330 3 0.3典型擴增產物條帶典型擴增產物條帶 10100 350 110分辨率分辨率 高高 中等中等 低低分離膠分離膠 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺 聚丙烯酰胺聚丙烯酰胺

37、瓊脂糖瓊脂糖顯色顯色 銀染銀染 放射性標記放射性標記 溴化乙錠染色溴化乙錠染色嚴謹度嚴謹度 低或高低或高 低和高低和高 低低(Multiple arbitrary amplicon profiling)DAF：DNA amplification fingerprinting AP-PCR：arbitrarily primed polymerase chain reaction 分子生物學研究法序列標志位點技術 序列標志位點（序列標志位點（sequence tag sites，STS）技術是）技術是一類基于特定引物序列形成的，利用一類基于特定引物序列形成的，利用PCR技術進行的技術進行的分子標記

38、技術。分子標記技術。 SSR（Simple Sequence Repeat）是是序列標志位點序列標志位點技術中的一種，它以某一微衛星座位兩側的單一序列技術中的一種，它以某一微衛星座位兩側的單一序列設計引物，擴增這個微衛星位點的序列，然后電泳檢設計引物，擴增這個微衛星位點的序列，然后電泳檢測產物的大小。由于在不同生物個體中這個座位核心測產物的大小。由于在不同生物個體中這個座位核心序列的重復次數可能不同，同一個體的兩條染色體的序列的重復次數可能不同，同一個體的兩條染色體的這個座位核心序列的重復次數也可能不同（雜合體），這個座位核心序列的重復次數也可能不同（雜合體），這個座位有許多不同長度的等位這個

39、座位有許多不同長度的等位“基因基因”（復等位（復等位“基因基因”）。）。SSR就是檢測不同個體間等位就是檢測不同個體間等位“基因基因”在長度上的差異。在長度上的差異。分子生物學研究法微衛星序列長度多態性測定微衛星序列長度多態性測定分子生物學研究法大豆大豆ATT5 SSR位點位點14個等位基因的大小個等位基因的大小分子生物學研究法單核苷酸多態性單核苷酸多態性(Single Nucleotide Polymorphism , SNP ) SNP是指基因組內是指基因組內DNA某一特定位置的核苷酸存某一特定位置的核苷酸存在置換、插入、缺失等變化，而且其中最少有一種等在置換、插入、缺失等變化，而且其中最

40、少有一種等位基因在群體中突變頻率不小于位基因在群體中突變頻率不小于1 %。 SNP 一般以置一般以置換為主，顛換與轉換之比為換為主，顛換與轉換之比為1 :2。轉換（轉換（transition）：用另一種嘌呤堿基代替原有的嘌）：用另一種嘌呤堿基代替原有的嘌呤堿基，或用另一種嘧啶堿基代替原有的嘧啶堿基。呤堿基，或用另一種嘧啶堿基代替原有的嘧啶堿基。顛換（顛換（transversion）：嘌呤堿基被嘧啶堿基所代替或）：嘌呤堿基被嘧啶堿基所代替或嘧啶堿基被嘌呤堿基所代替。嘧啶堿基被嘌呤堿基所代替。分子生物學研究法SNP 的研究狀況的研究狀況 目前人類基因組研究中目前人類基因組研究中SNP的研究最為廣泛

41、。大的研究最為廣泛。大多數多數SNP對蛋白質無直接的影響，因為絕大多數的對蛋白質無直接的影響，因為絕大多數的SNP位于非編碼區。目前已有的人類基因組位于非編碼區。目前已有的人類基因組SNP圖譜圖譜中共有中共有142萬個萬個SNP，但只有約，但只有約4. 23%的的SNP位于外顯位于外顯子內。子內。 除此，在果蠅、雞、犬類、豬、綿羊、牛等動物除此，在果蠅、雞、犬類、豬、綿羊、牛等動物上也開展了上也開展了SNP研究。在植物中展開研究。在植物中展開SNP廣泛研究的廣泛研究的種類則較少，近幾年僅在玉米、大麥、小麥、番茄、種類則較少，近幾年僅在玉米、大麥、小麥、番茄、水稻等農作物上開展了此項工作。水稻等

42、農作物上開展了此項工作。 分子生物學研究法編碼區內編碼區內 SNP 的意義的意義 在基因組在基因組DNA中，任何堿基均有可能發生變異，中，任何堿基均有可能發生變異，因此因此SNP既有可能在基因序列內，也有可能在基因既有可能在基因序列內，也有可能在基因以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區內的以外的非編碼序列上。總的來說，位于編碼區內的SNP（coding SNP，cSNP）比較少，因為在外顯子）比較少，因為在外顯子內，其變異率僅及周圍序列的內，其變異率僅及周圍序列的1/5。但它在遺傳性疾。但它在遺傳性疾病研究中卻具有重要意義，因此病研究中卻具有重要意義，因此cSNP的研究更受關的研究更受關注

43、。注。 分子生物學研究法SNP 的影響的影響 從對生物的遺傳性狀的影響上來看，從對生物的遺傳性狀的影響上來看，cSNP又可又可分為分為2種：種： 一種是同義一種是同義cSNP（synonymous cSNP），即），即cSNP所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋所致的編碼序列的改變并不影響其所翻譯的蛋白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基所在的密白質的氨基酸序列，突變堿基與未突變堿基所在的密碼子的含義相同。碼子的含義相同。 另一種是非同義另一種是非同義cSNP（non-synonymous cSNP），），指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋白質序列指堿基序列的改變可使以其為藍本翻譯的蛋

44、白質序列發生改變，從而影響了蛋白質的功能，這種改變常是發生改變，從而影響了蛋白質的功能，這種改變常是導致生物性狀改變的直接原因。導致生物性狀改變的直接原因。cSNP中約有一半為中約有一半為非同義非同義cSNP。分子生物學研究法SNP 用作遺傳標記的優點用作遺傳標記的優點 SNP用作遺傳標記具有以下優點：用作遺傳標記具有以下優點：（1）SNP在人群中是二等位基因性的，在任何人在人群中是二等位基因性的，在任何人群中其等位基因頻率都可估計出來。群中其等位基因頻率都可估計出來。（2）它在基因組中的分布較微衛星標記廣泛得多。）它在基因組中的分布較微衛星標記廣泛得多。（3）與串聯重復的微衛星位點相比，）與

45、串聯重復的微衛星位點相比，SNP是高度是高度穩定的，尤其是處于編碼區的穩定的，尤其是處于編碼區的cSNP，而串聯重復，而串聯重復的微衛星位點的高突變率容易引起對人群的遺傳分的微衛星位點的高突變率容易引起對人群的遺傳分析出現困難。析出現困難。分子生物學研究法SNP 用作遺傳標記的優點用作遺傳標記的優點（4）部分位于基因內部的）部分位于基因內部的SNP可能會直接影響產可能會直接影響產物蛋白質的結構或基因表達水平，因此，它們本身物蛋白質的結構或基因表達水平，因此，它們本身可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點。可能就是疾病遺傳機制的候選改變位點。（5）易于進行自動化、規模化分析，縮短了研究）易于進行自動

46、化、規模化分析，縮短了研究時間。由于時間。由于SNP的二態性，非此即彼，在基因組篩的二態性，非此即彼，在基因組篩選中選中SNPs往往只需往往只需+/-的分析，而不用分析片段的的分析，而不用分析片段的長度，這就利于發展自動化技術篩選或檢測長度，這就利于發展自動化技術篩選或檢測SNPs。分子生物學研究法檢測單核苷酸差異的方法檢測單核苷酸差異的方法單鏈構象多態性（單鏈構象多態性（Single Strand Conformation Polymorphism，SSCP） DNA片段雙鏈變性成單鏈后，在非變性條件下片段雙鏈變性成單鏈后，在非變性條件下會折疊成不同的空間構象，單鏈這種構象會因個別會折疊成不

47、同的空間構象，單鏈這種構象會因個別核苷酸置換而改變，長度相同或相近的單鏈在電泳核苷酸置換而改變，長度相同或相近的單鏈在電泳時由于構象不同而具不同遷移率，從而顯示出多態時由于構象不同而具不同遷移率，從而顯示出多態性。在性。在SSCP分析時，應先將擴增后的分析時，應先將擴增后的DNA片段變性片段變性為單鏈，然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。為單鏈，然后在非變性聚丙烯酰胺凝膠中電泳。分子生物學研究法檢測單核苷酸差異的方法檢測單核苷酸差異的方法基因芯片法基因芯片法 其基本原理是利用其基本原理是利用DNA分子的變性雜交特性，通過分子的變性雜交特性，通過DNA芯片上的芯片上的固定探針固定探針或樣品或樣品D

48、NA與與游離樣品游離樣品DNA或探針或探針雜交來推斷未知靶分子的序列，雜交發生與否可采用熒雜交來推斷未知靶分子的序列，雜交發生與否可采用熒光標記技術來檢測。由于該技術可將大量探針同時固定光標記技術來檢測。由于該技術可將大量探針同時固定于支持物上，所以一次可以對大量于支持物上，所以一次可以對大量DNA分子進行檢測分分子進行檢測分析，解決了傳統印跡雜交技術復雜、自動化程度低、檢析，解決了傳統印跡雜交技術復雜、自動化程度低、檢測目的分子少、效率低的問題。近年來的實驗結果指出，測目的分子少、效率低的問題。近年來的實驗結果指出，一次實驗就可以同時分析成千個多態性。一次實驗就可以同時分析成千個多態性。分子

49、生物學研究法檢測單核苷酸差異的方法檢測單核苷酸差異的方法 基因單堿基多態檢測的芯片一般采用等長移位基因單堿基多態檢測的芯片一般采用等長移位設計法，即按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互設計法，即按靶序列從頭到尾依次取一定長度的互補的核苷酸序列形成一探針組合，這組探針是與靶補的核苷酸序列形成一探針組合，這組探針是與靶序列完全匹配的野生型探針，然后對于每一野生型序列完全匹配的野生型探針，然后對于每一野生型探針，將其中間位置的某一堿基分別用其它三種堿探針，將其中間位置的某一堿基分別用其它三種堿基替換，形成三種不同的單堿基變化的核苷酸探針，基替換，形成三種不同的單堿基變化的核苷酸探針，這種設計可以對某一

50、段核酸序列所有可能的這種設計可以對某一段核酸序列所有可能的SNPs位位點進行掃描。點進行掃描。基因芯片法基因芯片法分子生物學研究法基因芯片法測 SNP 的探針設計AAAAAAAAAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAA

51、AGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAATAAAAAAAAGAAAAAAAGAAAAAAACAAAAAAACAAAAAAATAAAAAAAT 在芯片上，有如上序列在芯片上，有如上序列1-8的一組探針，還有的一組探針，還有9-16、17-24等組探針。（每一個探針的長度不一定是等組探針。（每一個探針的長度不一定是8）分子生物學研究法分子標記的應用領域 和經典的表型遺傳圖譜類似，

52、也可以將分子標和經典的表型遺傳圖譜類似，也可以將分子標記和表型標記混作于一張圖中，用于遺傳育種分析。記和表型標記混作于一張圖中，用于遺傳育種分析。 分子標記應與表型標記對應起來。分子標記應與表型標記對應起來。 以分子標記制作的遺傳圖譜密度要比表型標記以分子標記制作的遺傳圖譜密度要比表型標記大得多，可以更精確地分辨不同個體的遺傳差別。大得多，可以更精確地分辨不同個體的遺傳差別。 許多表型標記需要在生物個體發育到一定階段許多表型標記需要在生物個體發育到一定階段才能表現出來，而分子標記從胚胎期就可以分辨出才能表現出來，而分子標記從胚胎期就可以分辨出來。來。 分子標記可用于個體鑒別和親子鑒定。分子標記

53、可用于個體鑒別和親子鑒定。建立遺傳圖譜建立遺傳圖譜分子生物學研究法水稻的水稻的RAPD圖譜圖譜分子生物學研究法分子標記與性狀的聯系 近等基因系（近等基因系（Near lsogenic lines, NILs）幾）幾乎僅在目的性狀上存在差異，因此，一般凡是能乎僅在目的性狀上存在差異，因此，一般凡是能在近等基因系間揭示多態性的分子標記，極可能在近等基因系間揭示多態性的分子標記，極可能位于目的基因或其附近。如果沒有近等基因系可位于目的基因或其附近。如果沒有近等基因系可用，也可以采用分離群體分組分析法（用，也可以采用分離群體分組分析法（Bulked segregation analysis, BSA）

54、來尋找與目的基因緊）來尋找與目的基因緊密連鎖的分子標記。密連鎖的分子標記。 分子生物學研究法分離群體分組分析法 采用采用F2分離群體為材料，根據目的基因的表型分離群體為材料，根據目的基因的表型把把F2群體分成兩組（如抗病的和敏感的），在每組群體分成兩組（如抗病的和敏感的），在每組內，不管其他性狀如何，其目的基因的表型都是一內，不管其他性狀如何，其目的基因的表型都是一樣的，而這兩組之間在目的基因表型上是不同的。樣的，而這兩組之間在目的基因表型上是不同的。將每組內一定數量個體的將每組內一定數量個體的DNA混合，形成按表型區混合，形成按表型區分的分的DNA池，也稱近等基因池（池，也稱近等基因池（is

55、ogenic DNA pools），例如抗病池和敏感池，以兩池的），例如抗病池和敏感池，以兩池的DNA為模為模板，分別進行板，分別進行RAPD分析，二者的差異標記帶即很分析，二者的差異標記帶即很有可能與目的基因緊密連鎖。有可能與目的基因緊密連鎖。 分子生物學研究法RAPD標記與表型標記對應法標記與表型標記對應法分子生物學研究法三、基因文庫和目的基因的分離 為了深入揭示生命活動的奧秘，必須研究為了深入揭示生命活動的奧秘，必須研究基因的結構、功能、表達、調控。而要對某個基因的結構、功能、表達、調控。而要對某個特定基因進行研究，又必須把這個基因分離出特定基因進行研究，又必須把這個基因分離出來。為了在

56、龐大的基因組中準確地找出特定的來。為了在龐大的基因組中準確地找出特定的基因，首先需要建立基因文庫。基因，首先需要建立基因文庫。 1. .基因文庫的構建基因文庫的構建建立基因文庫的意義建立基因文庫的意義分子生物學研究法基因文庫的概念 基因文庫分為基因組文庫和基因文庫分為基因組文庫和cDNA文庫兩種。文庫兩種。 基因組文庫是將來自一個有機體的不同隨機基因組文庫是將來自一個有機體的不同隨機DNA序列片段與載體重組，轉化受體細胞，得到該序列片段與載體重組，轉化受體細胞，得到該物種基因組的一群重組體克隆。這些克隆的集合體物種基因組的一群重組體克隆。這些克隆的集合體即為基因組文庫，其中包含了該有機體基因組

57、的全即為基因組文庫，其中包含了該有機體基因組的全部序列。在這些克隆中，有序列重復和序列重疊。部序列。在這些克隆中，有序列重復和序列重疊。 cDNA文庫是提取某一生物材料（組織、細胞）文庫是提取某一生物材料（組織、細胞）的總的總mRNAs，反轉錄成，反轉錄成cDNAs，再與載體重組，轉，再與載體重組，轉化受體細胞，得到克隆的集合體。化受體細胞，得到克隆的集合體。（注意沒有酶切（注意沒有酶切步驟，與載體連接時的末端處理除外）步驟，與載體連接時的末端處理除外） 基因文庫的作用是從中篩選目的基因或特定序基因文庫的作用是從中篩選目的基因或特定序列。列。分子生物學研究法基因文庫的構建基因文庫的構建分子生物

58、學研究法基因組文庫的內容 基因組文庫包括了基因上游調控序列、內含基因組文庫包括了基因上游調控序列、內含子、外顯子、下游序列等，如果為了研究基因的子、外顯子、下游序列等，如果為了研究基因的結構和表達調控，應結構和表達調控，應建立基因組文庫；基因組文建立基因組文庫；基因組文庫還可以用于研究不同基因在染色體上的排列情庫還可以用于研究不同基因在染色體上的排列情況。基因組文庫實際上是況。基因組文庫實際上是DNA文庫，它是以文庫，它是以DNA片段為克隆對象，而不是以基因為克隆對片段為克隆對象，而不是以基因為克隆對象。象。 分子生物學研究法基因組文庫的大小 在建立高等真核生物的大型基因組在建立高等真核生物的

59、大型基因組DNA文庫文庫時，需要克隆大量的不同時，需要克隆大量的不同DNA片段，才能以一種片段，才能以一種合理的概率獲得含有目的基因的克隆。以人合理的概率獲得含有目的基因的克隆。以人珠蛋白基因為例，其大小約為珠蛋白基因為例，其大小約為1.5kb，而人的單，而人的單倍體基因組總長度為倍體基因組總長度為3106 kb左右，若按片段的左右，若按片段的平均長度為平均長度為1.5kb計算，理論克隆數為計算，理論克隆數為2百萬百萬（3106/1.5）。）。分子生物學研究法基因組文庫的大小 由于由于DNA片段是隨機克隆的，這個理論克片段是隨機克隆的，這個理論克隆數只是基因組文庫所需要的最小值。從統計學隆數只

60、是基因組文庫所需要的最小值。從統計學上講，這意味著一個只有理論克隆數的基因組文上講，這意味著一個只有理論克隆數的基因組文庫中含有一種特定的單拷貝基因的概率只有庫中含有一種特定的單拷貝基因的概率只有50%。而當基因組文庫的克隆數為而當基因組文庫的克隆數為2倍理論克隆數時，倍理論克隆數時，這個概率提高到這個概率提高到75%。因此，為了能夠以一種合。因此，為了能夠以一種合理的概率篩選出單拷貝的目的基因，一個完全的理的概率篩選出單拷貝的目的基因，一個完全的基因組文庫就必須含有基因組文庫就必須含有310倍于理論克隆數的倍于理論克隆數的克隆。克隆。分子生物學研究法實際克隆數的計算公式)1 (ln)1 (l