1、膽堿能抗炎通路調(diào)節(jié)肺泡巨噬細胞極化減輕急性肺損傷的機制研究背景與目的 : 急性肺損傷 (ALI) 為膿毒癥的常見并發(fā)癥 , 發(fā)病率和死亡率居高不下。肺泡巨噬細胞(AM)在ALI的防御和修復(fù)中起著重要的作用。在不同微環(huán)境刺激下,巨噬細胞可發(fā)生M1和M2極化，但AM的極化及對ALI 的影響尚不明確。GTS-21為膽堿能抗炎通路(CAP)選擇性a 7煙堿型乙酰膽堿受 體沖動劑(a 7nAChR),在ALI的治療中具有廣闊的應(yīng)用前景。然而,GTS-21介導(dǎo)的抑制炎癥反響的分子機制仍有局部不清楚。高遷移率族蛋白-1(HMGB1可激活黑素瘤缺乏因子2(AIM2)炎癥小體復(fù)合物引起促炎反響， 且兩者在 AL

2、I 中均具有重要的作用。然而HMGB與AIM2之間的相互作用機制尚不清楚。巨噬細胞可表達AIM2炎癥小體復(fù)合物和HMGB的主要受體：晚期糖基化終產(chǎn)物受體(RAGE) Toll樣受 體2、4(TLR 2、TLR4)來傳遞細胞內(nèi)信號。研究目的:1.探索GTS-21通過調(diào)節(jié)AM的極化功能來參與脂多糖(LPS)所致 ALI的抗炎機制;2.探索HMGB通過調(diào)節(jié)AM的極化功能來參與LPS所致ALI的炎 癥反響機制。方法：第一局部：從C57BL/6小鼠肺泡灌洗液(BALF)中提取AM刺激 后極化為M1型AM和 M2型AM再將M1和M2型AM分別注入去除AM的小鼠氣道,然后建立LPS所致ALI模 型,觀察M1

3、和M2型AM對LPS所致ALI小鼠肺損傷評分、肺水腫程度和肺部炎癥 因子的影響。第二局部：建立LPS所致ALI小鼠模型,分為空白對照組、LPS組、 GTS-21 組和 GTS-21+LPSSo體外培養(yǎng)AM在有無LPS和有無GTS-21的刺激下,分為同樣四組。通過體內(nèi) 和體外實驗觀察GTS-21對LPS所致ALI中AM的數(shù)量、AM的極化以及對HMGB1 分泌的影響。第三局部：應(yīng)用anti-HMGB1或rHMGB干預(yù)LPS所致ALI小鼠,測定干預(yù)措施 對肺組織炎癥損傷、AIM2炎癥小體復(fù)合物的蛋白以及mRNA表達。通過流式細胞 學檢測M1型AM外表相關(guān)因子MHCH、CD80 CD86 CD40和M

4、2型AM外表相關(guān) 因子CD206 IL-10的表達水平。體外培養(yǎng)骨髓來源的巨噬細胞,觀察Anti-HMGB1或rHMGB刺激后AIM2炎癥 小體復(fù)合物的蛋白以及 mRN表達以及M1和M2型AM外表相關(guān)因子的表達。第四 局部：為了驗證HMGB對巨噬細胞的作用通路,應(yīng)用anti-HMGB1或rHMGB作用于 LPS所致ALI小鼠,觀察TLR2/4、RAG受體和NF- k B表達水平的變化；應(yīng)用TLR2/4 和RAGEg體拮抗劑作用于LPS所致ALI小鼠，觀察肺部炎癥和AIM2炎癥小體復(fù) 合物的變化。在體外培養(yǎng)的巨噬細胞中參加以上干預(yù)措施，觀察AIM2炎癥小體復(fù)合物的 變化。結(jié)果:1M1型AM可加重

5、LPS所致ALI的促炎反響。主要表現(xiàn)為：肺MPO舌性增強,肺 W/D上升,BALF中TNF- a、IL-6、IL-1 B、 MCP-1的水平明顯增高。M2型AM可減輕LPS所致ALI小鼠的炎癥反響,主要表 現(xiàn)為肺損傷評分降低,肺MPO舌性和肺W/D減低,BALF中MCP-1的水平降低。在LPS所致ALI小鼠中,GTS-21可減輕肺組織炎癥,減少AM的數(shù)量及炎 癥因子的表達，降低肺組織、血漿以及 BALF中HMGB的分泌和表達。GTS-21可 降低LPS所致ALI小鼠和體外培養(yǎng)的AM中M1型AM生物活性分子iNOS和促炎因 子TNF- a、IL-6、IL-12的水平,增加M2型AM生物活性分子A

6、rg1、Ym1和抗 炎因子CCL17 CCL22 CCL24的水平。抗HMGB抗體可減輕LPS所致ALI小鼠肺組織炎癥,抑制AIM2炎癥小體復(fù)合物的活性,抑制AM向 M1極化;rHMGB何增加LPS所致ALI小鼠肺組織炎癥, 增強AIM2炎癥小體復(fù)合物的活性,促進AM向M1極化。 抗HMGB抗體可下調(diào) LPS所致ALI中TLR 2、TLR 4和RAGE/NFk B的表達;rHMGB 1可上調(diào)上述受體 的表達；(TLR2、TLR4受體拮抗劑)LPS-RS和(RAGE受體拮抗劑)FPS-ZM1能抑制 LPS所致ALI肺部炎癥，降低AIM 2炎癥小體復(fù)合物的表達。結(jié)論:(1)M1型AM可加重LPS所致ALI肺組織炎癥;M2型AM可減輕LPS所致ALI肺組織炎癥。膽堿能抗炎通路可通過減少 AM的數(shù)量,抑制M1型AM的極 化,抑制AM內(nèi)HMGB 1的分泌來減輕LPS所致ALI。(3)HMGB何通過激活A(yù)IM2炎癥小體復(fù)合物和促進 AM的M