1、堿裂解法提取質(zhì)粒一、基本概念 1質(zhì)粒：質(zhì)粒是染色體外能夠進行自主復制的遺傳單位，包括真核生物的細胞器和細菌細胞中染色體以外的脫氧核糖核酸(DNA)分子。現(xiàn)在習慣上用來專指細菌、酵母菌和放線菌等生物中染色體以外的DNA分子。在基因工程中質(zhì)粒常被用做基因的載體。許多細菌除了染色體外，還有大量很小的環(huán)狀DNA分子，這就是質(zhì)粒(plasmid)。質(zhì)粒上常有抗生素的抗性基因，例如，四環(huán)素抗性基因或卡那霉素抗性基因等。有些質(zhì)粒稱為附加體(episome)，這類質(zhì)粒能夠整合進細菌的染色體，也能從整合位置上切離下來成為游離于染色體外的DNA分子。 目前，已發(fā)現(xiàn)有質(zhì)粒的細菌有幾百種，已知的絕大多數(shù)的細菌質(zhì)粒都是

2、閉合環(huán)狀DNA分子(簡稱cccDNA)。細菌質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量一般較小，約為細菌染色體的0.5%3%。根據(jù)相對分子質(zhì)量的大小，大致上可以把質(zhì)粒分成大小兩類：較大一類的相對分子質(zhì)量是40106以上，較小一類的相對分子質(zhì)量是10106以下(少數(shù)質(zhì)粒的相對分子質(zhì)量介于兩者之間)。每個細胞中的質(zhì)粒數(shù)主要決定于質(zhì)粒本身的復制特性。按照復制性質(zhì)，可以把質(zhì)粒分為兩類：一類是嚴緊型質(zhì)粒，當細胞染色體復制一次時，質(zhì)粒也復制一次，每個細胞內(nèi)只有12個質(zhì)粒;另一類是松弛型質(zhì)粒，當染色體復制停止后仍然能繼續(xù)復制，每一個細胞內(nèi)一般有20個左右質(zhì)粒。一般分子量較大的質(zhì)粒屬嚴緊型。分子量較小的質(zhì)粒屬松弛型。質(zhì)粒的復制有時和

3、它們的宿主細胞有關，某些質(zhì)粒在大腸桿菌內(nèi)的復制屬嚴緊型，而在變形桿菌內(nèi)則屬松弛型。 在基因工程中，常用人工構建的質(zhì)粒作為載體。人工構建的質(zhì)粒可以集多種有用的特征于一體，如含多種單一酶切位點、抗生素耐藥性等。常用的人工質(zhì)粒運載體有pBR322、pSC101。pBR322含有抗四環(huán)素基因(Tcr)和抗氨芐青霉素基因(Apr)，并含有5種內(nèi)切酶的單一切點。如果將DNA片段插入EcoRI切點，不會影響兩個抗生素基因的表達。但是如果將DNA片段插入到HindIII、BamHI或SalI切點，就會使抗四環(huán)素基因失活。這時，含有DNA插入片段的pBR322將使宿主細菌抗氨芐青霉素，但對四環(huán)素敏感。沒有DNA

4、插入片段的pBR322會使宿主細菌既抗氨芐青霉素又抗四環(huán)素，而沒有pBR322質(zhì)粒的細菌將對氨芐青霉素和四環(huán)素都敏感。pSC101與pBR322相似，只是沒有抗氨芐青霉素基因和PstI切點。質(zhì)粒運載體的最大插入片段約為10kb(kb表示為千堿基對)。pGEX-4T1是pGEX載體系列的一種，載體圖如圖2所示，這類載體是溶蛋白表達、純化和檢測為一體的整合系統(tǒng)。具有以下優(yōu)點：有一個可以用化學物質(zhì)（IPTG）誘導的高效表達的tac啟動子；一個lacIq基因以便通用于所有E.coli宿主中；一個AmpiR基因以便于陽性克隆的篩選。 pGEX-4T1載體示意圖2感受態(tài)細胞：重組DNA分子體外構建完成后，

5、必須導入特定的宿主（受體）細胞，使之無性繁殖并高效表達外源基因或直接改變其遺傳性狀，這個導入過程及操作統(tǒng)稱為重組DNA分子的轉(zhuǎn)化。在原核生物中，轉(zhuǎn)化是一個較普遍的現(xiàn)象，在細胞間轉(zhuǎn)化是否發(fā)生，一方面取決于供體菌與受體菌兩者在進化過程中的親緣關系，另一方面還與受體菌是否處于一種感受狀態(tài)有著很大的關系。 所謂的感受態(tài)，即指受體（或者宿主）最易接受外源DNA片段并實現(xiàn)其轉(zhuǎn)化的一種生理狀態(tài)，它是由受體菌的遺傳性狀所決定的，同時也受菌齡、外界環(huán)境因子的影響。cAMP可以使感受態(tài)水平提高一萬倍，而Ca2+也可大大促進轉(zhuǎn)化的作用。細胞的感受態(tài)一般出現(xiàn)在對數(shù)生長期，新鮮幼嫩的細胞是制備感受態(tài)細胞和進行成功轉(zhuǎn)化的

6、關鍵。 制備出的感受態(tài)細胞暫時不用時，可加入占總體積15%的無菌甘油或-70保存（有效期6個月）。3.轉(zhuǎn)化:是將異源DNA分子引入一細胞株系，使受體細胞獲得新的遺傳性狀的一種手段，是基因工程等研究領域的基本實驗技術。 進入細胞的DNA分子通過復制表達，才能實現(xiàn)遺傳信息的轉(zhuǎn)移，使受體細胞出現(xiàn)新的遺傳性狀。轉(zhuǎn)化過程所用的受體細胞一般是限制修飾系統(tǒng)缺陷的變異株，即不含限制性內(nèi)切酶和甲基化酶的突變株。轉(zhuǎn)化的方法：化學的方法(熱擊法)；使用化學試劑（如CaCl）制備的感受態(tài)細胞，通過熱擊處理將載體DNA分子導入受體細胞；電轉(zhuǎn)化法：使用低鹽緩沖液或水洗制備的感受態(tài)細胞，通過高壓脈沖的作用將載體DNA分子導

7、入受體細胞。二、堿裂解法質(zhì)粒提取的原理堿裂解法從大腸桿菌制備質(zhì)粒，是從事分子生物學研究的實驗室每天都要用的常規(guī)技術。下面是該法的提取原理: 堿法質(zhì)粒抽提用到三種溶液：溶液I，50 mM葡萄糖 / 25 mM Tris-Cl / 10 mM EDTA，pH 8.0；溶液II，0.2 N NaOH / 1% SDS；(N相當于g/L，是當量濃度)溶液III，3 M 醋酸鉀 / 2 M 醋酸。 溶液I的作用任何生物化學反應，首先要控制好溶液的pH，因此用適當濃度的和適當pH值的Tris-Cl溶液，是再自然不過的了。那么50 mM葡萄糖是干什么的呢？說起來不可思議，加了葡萄糖后最大的好處只是懸浮后的大

8、腸桿菌不會快速沉積到管子的底部。EDTA是Ca2+和Mg2+等二價金屬離子的螯合劑，配在分子生物學試劑中的主要作用是：抑制DNase的活性，和抑制微生物生長。在溶液I中加入EDTA是要把大腸桿菌細胞中的所有二價金屬離子都螯合掉，菌體一定要懸浮均勻，不能有結塊。 溶液II的作用這是用新鮮的0.4 N的NaOH和2的SDS等體積混合后使用的。要新從濃NaOH稀釋制備0.4N的NaOH，是為了保證NaOH沒有吸收空氣中的CO2而減弱了堿性。其實破細胞的主要是堿，而不是SDS，所以才叫堿法抽提。事實上NaOH是最佳的溶解細胞的試劑，不管是大腸桿菌還是哺乳動物細胞，碰到了堿都會幾乎在瞬間就溶解，這是由于

9、細胞膜發(fā)生了從bilayer（雙層膜）結構向micelle（微囊）結構的相變化所導致。用了不新鮮的0.4 N NaOH，即便是有SDS也無法有效溶解大腸桿菌，自然就難高效率抽提得到質(zhì)粒。如果只用SDS當然也能抽提得到少量質(zhì)粒，因為SDS也是堿性的，只是弱了點而已。很多人對NaOH的作用誤以為是為了讓基因組DNA變性，以便沉淀，這是由于沒有正確理解一些書上的有關DNA變性復性的描述所導致。有人不禁要問，既然是NaOH溶解的細胞，那為什么要加SDS呢？那是為下一步操作做的鋪墊。這一步要記住兩點：第一，時間不能過長，因為在這樣的堿性條件下基因組DNA片斷會慢慢斷裂；第二，必須溫柔混合，不然基因組DN

10、A也會斷裂。基因組DNA的斷裂會帶來麻煩。 溶液III的作用溶液III加入后就會有大量的沉淀，與SDS的加入有關系。十二烷基硫酸鈉（sodium dodecylsulfate）SDS遇到鉀離子后變成了十二烷基硫酸鉀（potassium dodecylsulfate, PDS），而PDS是水不溶的，因此發(fā)生了沉淀。溶液III加入后的沉淀實際上是鉀離子置換了SDS中的鈉離子形成了不溶性的PDS，而高濃度的鹽，使得沉淀更完全。大家知道SDS專門喜歡和蛋白質(zhì)結合，平均兩個氨基酸上結合一個SDS分子，鉀鈉離子置換所產(chǎn)生的大量沉淀自然就將絕大部分蛋白質(zhì)沉淀了，讓人高興的是大腸桿菌的基因組DNA也一起被共沉

11、淀了。這個過程不難想象，因為基因組DNA太長了，長長的DNA自然容易被PDS給共沉淀了，盡管SDS并不與DNA分子結合。 2 M的醋酸是為了中和NaOH，因為長時間的堿性條件會打斷DNA，所以要中和之。基因組DNA一旦發(fā)生斷裂，只要是50100 kb大小的片斷，就沒有辦法再被PDS共沉淀了。所以堿處理的時間要短，而且不得激烈振蕩，不然最后得到的質(zhì)粒上總會有大量的基因組DNA混入，瓊脂糖電泳可以觀察到一條濃濃的總DNA條帶。很多人誤認為是溶液III加入后基因組DNA無法快速復性就被沉淀了，這是天大的誤會，因為變性的也好復性的也好，DNA分子在中性溶液中都是溶解的。NaOH本來是為了溶解細胞而用的

12、，DNA分子的變性其實是個副產(chǎn)物，與它是不是沉淀下來其實沒有關系。溶液III加入并混合均勻后在冰上放置，目的是為了PDS沉淀更充分一點。 酚/氯仿純化 不要以為PDS沉淀的形成就能將所有的蛋白質(zhì)沉淀了，其實還有很多蛋白質(zhì)不能被沉淀，因此要用酚/氯仿/異戊醇進行抽提，然后進行酒精沉淀才能得到質(zhì)量穩(wěn)定的質(zhì)粒DNA，不然時間一長就會因為混入的DNase而發(fā)生降解。這里用25/24/1的酚/氯仿/異戊醇是有很多道理的，這里做個全面的介紹。酚（Phenol）對蛋白質(zhì)的變性作用遠大于氯仿，按道理應該用酚來最大程度將蛋白質(zhì)抽提掉，但是水飽和酚的比重略比水重，碰到高濃度的鹽溶液（比如4M的異硫氰酸胍），離心后

13、酚相會跑到上層，不利于含質(zhì)粒的水相的回收；但加入氯仿后可以增加比重，使得酚/氯仿始終在下層，方便水相的回收；還有一點，酚與水有很大的互溶性，如果單獨用酚抽提后會有大量的酚溶解到水相中，而酚會抑制很多酶反應（比如限制性酶切反應），因此如果單獨用酚抽提后一定要用氯仿抽提一次將水相中的酚去除，而用酚/氯仿的混合液進行抽提，跑到水相中的酚則少得多，微量的酚在乙醇沉淀時就會被除干凈而不必擔心酶切等反應不能正常進行。至于異戊醇的添加，其作用主要是為了讓離心后上下層的界面更加清晰，也方便了水相的回收。 回收后的水相含有足夠多的鹽，因此只要加入2倍體積的乙醇，在室溫放置幾分鐘后離心就可以將質(zhì)粒DNA沉淀出來。

14、這時候如果放到20，時間一長反而會導致大量鹽的沉淀，這點不同于普通的DNA酒精沉淀回收，所以不要過分小心了。高濃度的鹽會水合大量的水分子，因此DNA分子之間就容易形成氫鍵而發(fā)生沉淀。如果感覺發(fā)生了鹽的沉淀，就用70的乙醇多洗幾次，每次在室溫放置一個小時以上，并用tip將沉淀打碎，就能得到好的樣品。得到的質(zhì)粒樣品一般用含RNase（50 ug/ml）的TE緩沖液進行溶解，不然大量未降解的RNA會干擾電泳結果的。質(zhì)粒檢測 瓊脂糖電泳進行鑒定質(zhì)粒DNA時，多數(shù)情況下你能看到三條帶，但千萬不要認為你看到的是超螺旋、線性和開環(huán)這三條帶。堿法抽提得到質(zhì)粒樣品中不含線性DNA，不信的話你用EcoRI來線性化

15、質(zhì)粒后再進行瓊脂糖電泳，就會看到線性質(zhì)粒DNA的位置與這三條帶的位置不一樣。其實這三條帶以電泳速度的快慢而排序，分別是超螺旋、開環(huán)和復制中間體（即沒有復制完全的兩個質(zhì)粒連在了一起）。如果你不小心在溶液II加入后過度振蕩，會有第四條帶，這條帶泳動得較慢，遠離這三條帶，是20-100kb的大腸桿菌基因組DNA的片斷。 非常偶然的是，有時候抽提到的質(zhì)粒會有710條帶，這是由于特殊的DNA序列導致了不同程度的超螺旋（超螺旋的圈數(shù)不同）所致。三、實驗步驟1大腸桿菌感受態(tài)細胞的制備（可臨用前準備，也可制備多管加甘油凍存-80）（1）從新鮮的DH5菌株平板上挑取一個單菌落，（接種到4ml LB液體培養(yǎng)基中）

16、37，180rpm培養(yǎng)過夜。（2）次日按照1：100的比例轉(zhuǎn)接培養(yǎng)物于20mlLB液體培養(yǎng)基當中，37，180rpm培養(yǎng)至OD值達到0.4-0.6。（3）取培養(yǎng)物1ml到1.5ml 離心管中，冰浴10min，5000rpm離心5min收集菌體。（4）棄上清，加入預冷的0.1M CaCl2 1ml 后旋起菌體（在渦旋器上振蕩），冰浴30min。（5）5，000rpm離心10min后棄上清，加入預冷的0.1M CaCl2 100ul。（6）溫和混勻后4放置24-48h備用。2質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化（1）取制備好的感受態(tài)菌體，加入質(zhì)粒5ul（可變）。（2）冰浴30min后，42水浴熱激90s（溫度準確，速度要快

17、把握好時間）。（3）取出后再冰浴5min；加入800ul LB液體培養(yǎng)基。（4）37，150rpm復蘇1h。（5）取10ul培養(yǎng)物涂布于含有抗生素的LB（由質(zhì)粒的抗性決定），37倒置培養(yǎng)。（對照組不加抗生素）3質(zhì)粒提取（或用試劑盒提取）（1）從4拿出長滿菌體的LB平板，打開培養(yǎng)皿，用在酒精燈上燒過的鑷子夾取100ul的吸頭挑取單菌落，之后把帶有菌落的吸頭放入帶有抗生素的LB液體培養(yǎng)基（4ml或10ml，認真標記）37振蕩培養(yǎng)過夜。（若是第二天進行二次活化，則按照1：20的比例接種培養(yǎng)基，37振蕩培養(yǎng)3小時，記得加抗生素）。（2）取1ml菌液加入1.5ml的離心管中，認真標記后把剩余的菌液凍存（

18、0.5ml的菌液，0.5ml純的甘油，認真標記）12，000rpm離心5min收集菌體。（3）5000rpm離心5min收集菌體，棄上請后再離心5s,吸取殘余的上清。（4）向每個離心管中各加入100ul預冷的溶液,在混懸器上振蕩使菌體充分懸浮，分散。（在冰上）（5）再向每個離心管中各加入200ul新配制的溶液，緩慢倒轉(zhuǎn)幾次混勻。（在冰上）（6）向每個離心管中各加入150ul溶液，緩慢倒轉(zhuǎn)幾次混勻。（在冰上）（7）12，000rpm離心10min，轉(zhuǎn)移上清至一新離心管中。（8）向每個離心管中各加入酚/氯仿/異戊醇（25：24：1），顛倒混勻后12，000rpm離心10min。（9）吸取上清（注意

19、不要吸到中間層）到1.5ml離心管中，加入2倍體積預冷的無水乙醇，于-20放置20-30min（或室溫放置10min）12，000rpm離心10min，棄上清，（小心不要把質(zhì)粒倒掉）（10）加1ml 70乙醇洗滌沉淀（來回顛倒旋轉(zhuǎn)幾次），12，000rpm離心3min，棄上清，室溫干燥20min，將沉淀溶于20ul的TE或水中，-20備用。注：一般在第二步離心收集完菌體后再加入1mlSTE，充分洗滌菌體，12，000rpm，離心12min。4質(zhì)粒檢測瓊脂糖凝膠電泳核酸DNA在PH高于其等電點的溶液中帶負電荷，在電場中向正極移動。瓊脂糖具有多孔的網(wǎng)狀結構，不同大小的核酸分子利用凝膠的分子篩效應得

20、以分開。實踐中觀察瓊脂糖凝膠中DNA是利用熒光染料溴化已錠（EB）將DNA染色。溴化已錠與DNA結合，在254nm波長的紫外燈下呈現(xiàn)橙黃色的熒光條帶。（1）以配制濃度為1%膠為例：取一個50ml錐形瓶（制膠專用），加入0.5g瓊脂糖后加1TAE至50ml放入微波爐內(nèi)加熱（火力中高，時間3min），待液體沸騰后拿出錐形瓶（注意不要燙住手），用吸取50ul的EB（1：1000）加入錐形瓶內(nèi)。等到錐形瓶不燙手后向制膠板內(nèi)倒膠，高度不要漫過制膠板沿，冷卻，待膠凝固后拔出梳子。（2）配制電泳液：取一個500ml的廣口瓶，加入10ml 50TAE，加雙蒸水至500ml。（3）待膠板放進電泳槽后向電泳槽內(nèi)加

21、入配好的電泳液，高度漫過膠板1mm。 （4）點樣：拿出裁成長條的稱量紙光面向上（或一次性手套），用10ul移液器吸取3ul的質(zhì)粒，打在稱量紙上，再用10ul移液器吸取2ul的上樣緩沖液和質(zhì)粒混勻，吸取混合液5ul打入點樣孔。（5）電泳：接通電源，電壓設定在80v（可變），開始電泳。（6）凝膠系統(tǒng)成相：等到指示劑快跑到膠板前沿時關閉電源，拿出膠板，放在暗箱內(nèi)，打開與暗箱相連的電腦，進入攝像軟件，進行攝像，然后保存照片。注：DNA分子的大小 在凝膠中，DNA片段遷移距離（遷移率）與堿基對的對數(shù)成反比，因此通過已知大小的標準物移動的距離與未知片段的移動距離時行比較，便可測出未知片段的大小。但是當DN

22、A分子大小超過20kb時，普通瓊脂糖凝膠就很難將它們分開。此時電泳的遷移率不再依賴于分子大小，因此，就用瓊脂糖凝膠電泳分離DNA時，分子大小不宜超過此值。瓊脂脂糖的濃度 如下表所示，不同大小的DNA需要用不同濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳分離。不同濃度瓊脂糖凝膠分離DNA片段的范圍瓊脂糖濃度 /%0.30.60.70.91.21.52.0線狀DNA大小/kb60-520-110-0.87-0.56-0.44-0.23-0.1四、溶液配方（詳細參考分子克隆實驗指南）LB液體培養(yǎng)基：每配制1000ml加入胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g。LB固體培養(yǎng)基：每配制1000ml加入胰蛋白胨10

23、 g、酵母提取物5g、NaCl 10g、瓊脂糖1.5g。溶液：50 mM葡萄糖，25 mM Tris-HCl (pH8.0)，10 mM EDTA (pH8.0)。溶液：0.2 M NaOH(臨用前用10 M貯存液稀釋)，10%SDS(現(xiàn)用現(xiàn)配)。溶液：60ml 5 M乙酸鉀，11.5ml冰乙酸，28.5ml水。TAE(50)：242g Tris堿，57.1 ml冰乙酸，100 ml 0.5 M EDTA (pH8.0)，用時稀釋50倍。加樣緩沖液(6)：0.25%溴酚藍，40%(w/v)蔗糖水溶液。溴化乙錠（或其無毒替代品）：10mg/ml。 RNA酶A母液：將RNA酶A溶于10mmol/L

24、 TrisCl(pH7.5), 15mmol/L NaCl中,配成10mg/ml的溶液,于100加熱15分鐘,使混有的DNA酶失活。冷卻后用1.5ml eppendorf管分裝成小份保存于-20。STE：0.1mol/L NaCl，10mmol/L TrisCl(pH8.0)，1mmol/L EDTA (pH8.0)。五、常見問題1. 加入solution.III，經(jīng)10分鐘離心后細菌沉淀怎么不結實，有的漂浮在液面，有的貼在離心管壁上，一搖晃即破碎脫落下來？ 細菌的用量太少，導致產(chǎn)生的沉淀主要是鹽分的沉淀，因為缺少變性的細菌蛋白和細菌基因組DNA 的纏繞，沉淀就顯得不結實。解決方法：將細菌的用

25、量增加。2.加入soln.III，經(jīng)10分鐘離心后細菌沉淀怎么不結實，呈大塊的水泡狀，上清較少？ （1）使用了過多的細菌，導致菌體未被有效裂解。解決方法：將細菌用量減半。 （2）細菌懸浮不充分,存留小菌塊, 導致菌體未被有效裂解。解決方法：注意將細菌懸浮充分。 （3）加Solution III后中和不充分。解決方法：如果細菌用量較多，請注意多翻轉(zhuǎn)幾次直至中和后的沉淀呈松散的豆腐花狀(也可以稍用力混合直至沉淀呈松散的豆腐花狀)。 （4）Solution II出現(xiàn)沉淀。解決方法：如果實驗室內(nèi)溫度低于15，使用試劑盒前請注意觀察Solution II中是否出現(xiàn)沉淀。如果出現(xiàn)沉淀，請于37水浴溶解沉淀后再使用。 （5）Solution II 長時間暴露于空氣中被CO2中和，導致菌體未能被有效裂解。解決方法：可用經(jīng)典堿裂解法抽提質(zhì)粒DNA方法中的II液替代 Solution II使用。3.出現(xiàn)嚴重的R