1、實驗六酵母rna的提取與含量測定13生物基地 201300140059 劉洋 2015-05-10同組者：張奕一、實驗目的1.掌握稀堿法提取酵母rna的原理和方法。2.掌握紫外分光光度計的使用。3.了解和掌握紫外吸收法測定rna濃度的原理。二、實驗原理 酵母核酸中rna含量較多，dna則少于2%。rna可溶于堿性溶液，當堿被中和后，可加乙醇使其沉淀，由此即可得到rna制品。但是用堿液提取的rna有不同的降解。 核酸及其衍生物，核苷酸、核苷、嘌呤和嘧啶有吸收紫外光的性質，其吸收高峰在260nm左右，且一定濃度范圍內其濃度與吸光度成正比（濃度為5g/ml45g/ml吸光度與濃度成正比），利用此性質

2、，可用rna標準液繪制rna吸光標準曲線(標準曲線的斜率為0.022-0.024左右)，測定樣品rna濃度。由于蛋白質在280nm的光吸收，對核酸測定有一定的干擾作用，最大吸收峰在280nm處，原因是蛋白質組成中常含有酪氨酸和色氨酸等芳香族氨基酸。所以如果有蛋白質的干擾必須得先測260nm處的吸光度，再測280nm處的吸光度，通過計算消除其對核酸的影響。三、實驗器材干酵母粉電子天平量筒容量瓶100ml磁力攪拌器試管100水浴鍋ph試紙（ph1-14）燒杯離心機722型分光光度計錐形瓶離心管四、實驗試劑0.2%氫氧化鈉溶液95%乙醇無水乙醚酸性乙醇（5ml濃hcl加入到500ml95%乙醇中混勻

3、）rna標準蛋白溶液（200g/ml）五、實驗步驟1.rna的提取（1）稱取4g干酵母粉，放入200ml錐形瓶中，加入40ml0.2%的氫氧化鈉 溶液混勻，在沸水浴中煮沸30min中并冷卻；（2）冷卻后，把液體倒入離心管中，在4000r/min的條件下離心15min；（3） 離心后留上清液加入95%的酸性乙醇40ml，邊加邊攪拌，靜置5min左右，再4000r/min的條件下離心5min；（4）離心后保留沉淀，用20ml 95%乙醇分兩次洗滌沉淀，每次洗后在3000r/min的條件下離心5min；（5）離心后的沉淀再用無水乙醇10ml洗滌兩次，每次用3000r/min離心5min；（6）離心結

4、束后，收集沉淀與濾紙上，稱重備用。2.rna樣液的配制（1）取粗rna0.2-0.25g與燒杯中，加入5mlnaoh溶液，攪拌，溶解，調成糊狀。（2）再加入蒸餾水40ml，攪拌混勻，調ph至7.0后，放入100ml容量瓶中定容。（3）再分3-4次分別取2ml定容后溶液于100ml容量瓶中繼續定容待測,并且把容量瓶依次編號為a、b、c。3.rna標準曲線的繪制（1）取潔凈的試管，依次標號為1-10、a、b、c后，按照下表分別往各試管中加所需液體，并用磁力攪拌器混勻。（2）混勻后以0號試管為參比液，在260nm下測各試管的吸光度a，并根據0-9試管的吸光值繪制出rna標準曲線，并最終得出樣品的濃度

5、。六、注意事項1.離心機的使用，使用前一定要將兩離心液（包括外殼）在天平上調平，對稱放置在離心機上，防止力臂不對稱而損壞離心機。2.紫外分光光度計的使用，要先預熱10分鐘，往比色皿中到液體只需到三分之二即可，防止液體溢出腐蝕儀器，愛護儀器。 七、實驗結果1.rna樣液的配制 稱取rna樣品的質量：0.200g2.rna標準曲線的繪制表一 紫外光測rna標準溶液配制表編號123(舍棄)45(舍棄)6(舍棄)78910樣品（ml）00.51.01.52.02.53.03.54.04.5水（ml）10.09.59.08.58.07.57.06.56.05.5總體積（ml）10.010.010.010

6、.010.010.010.010.010.010.0濃度（g/ml）05.010.015.020.025.030.035.040.045.0a260nm00.0740.1920.2340.4470.4430.4960.5800.6640.743表二 紫外光測樣品rna濃度溶液配制表編號1112131415(保留)1617(保留)1819樣品（ml）2.51.00.50.20.20.20.20.20.2水（ml）2.54.04.59.89.89.89.89.89.8總體積（ml）5.05.05.010.010.010.010.010.010.0總稀釋倍數2005001000500050005000500050005000a260nm/2.1800.4210.4710.5700.4690.4290.380樣品a260nm = 0.470計算得濃度c=1424.24g/ml質量=0.142g質量分數=71.2%八、討論與結論1提取的rna干燥后，最終得到是乳白色的塊狀固體，而純度較高的rna干燥后應為白色，根據其顏色可分析出其純度較低，含有雜質較多，原因為洗滌時未洗干凈。2.在測定rna樣液時，一定要避免假重復，不是取二次定容后的樣液連測三次，而是取第一次定容后的樣液取三次，分別再定容一次，分別測定，這樣可以