1、教材：教材： l新編生物工藝學新編生物工藝學下冊下冊 俞俊棠俞俊棠 參考教材參考教材 生物工業下游技術生物工業下游技術 毛宗貴毛宗貴 生物工程下游技術生物工程下游技術（第二版）（第二版） 劉國詮劉國詮 l現代生物分離工程現代生物分離工程 曹學君曹學君 l生化分離工程生化分離工程 嚴希康嚴希康 l生物分離工程生物分離工程 孫彥孫彥 l生物分離技術生物分離技術 譚天偉譚天偉 本課程主要內容本課程主要內容 n 生物下游加工過程生物下游加工過程概論、概論、發酵液的發酵液的預處理預處理 和固液分和固液分離方法、細胞離方法、細胞破碎、沉淀破碎、沉淀法、法、膜膜 分離分離技術、技術、溶劑萃取溶劑萃取法、法、

2、雙水相雙水相萃取、萃取、吸吸 附附法、法、離子交換離子交換法、液相色譜法、親和分法、液相色譜法、親和分 離技術、結晶法、基因工程藥物生產實例離技術、結晶法、基因工程藥物生產實例 等等 成績成績 平時成績占平時成績占30%30%，包括平時作業、課堂，包括平時作業、課堂( (實驗實驗 報告，提問報告，提問, ,點名點名) )等。等。 期末考試占期末考試占70%70%，閉卷考試方法總成績，閉卷考試方法總成績: :平時平時 (30%)+(30%)+期末期末(70%)(70%)。 n下游技術（工程）下游技術（工程） （downstreamprocessing）： n對于由生物界自然產生的或由微生物菌體對

3、于由生物界自然產生的或由微生物菌體 發酵的、動植物細胞組織培養的、酶反應發酵的、動植物細胞組織培養的、酶反應 等各種生物工業生產過程獲得的生物等各種生物工業生產過程獲得的生物原料原料， 經經提取分離、加工并精制目的成分提取分離、加工并精制目的成分，最終，最終 使其成為產品的技術。使其成為產品的技術。 v下游技術下游技術（工程）（工程） （downstream processing）：對于由對于由 生物界自然產生的或由微生物菌體發酵的、動植物細胞組生物界自然產生的或由微生物菌體發酵的、動植物細胞組 織培養的、酶反應等各種生物工業生產過程獲得的生物原織培養的、酶反應等各種生物工業生產過程獲得的生物

4、原 料，經提取分離、加工并精制目的成分，最終使其成為產料，經提取分離、加工并精制目的成分，最終使其成為產 品的技術。品的技術。 v 1、下游加工過程的重要性。（組成、費用和關注程度）、下游加工過程的重要性。（組成、費用和關注程度） 組成組成：下游加工過程是生物技術的重要組成部分，發酵液或反應：下游加工過程是生物技術的重要組成部分，發酵液或反應 液需要經過下游加工過程才能成為成品；液需要經過下游加工過程才能成為成品； 費用費用：傳統發酵工業中下游部分的費用占整個工廠投資費用的：傳統發酵工業中下游部分的費用占整個工廠投資費用的 ，而對重組生產蛋白質等基因工程產品，下游加工的費，而對重組生產蛋白質等

5、基因工程產品，下游加工的費 用可占整個生產費用的；用可占整個生產費用的； 關注程度關注程度：從第一個基因工程藥物，人胰島素在從第一個基因工程藥物，人胰島素在19821982年投產后，年投產后， 人們逐漸認識到下游加工過程的落后有可能會阻礙生物技術的發展。人們逐漸認識到下游加工過程的落后有可能會阻礙生物技術的發展。 英國英國政府工業部，于政府工業部，于19831983年發起生物分離計劃年發起生物分離計劃(BIOSEP)(BIOSEP)，專門研，專門研 究下游加工過程，有究下游加工過程，有7 7個國家、個國家、5050家公司參加。家公司參加。19871987年英國化學工業年英國化學工業 會召開了專

6、門討論下游加工過程的國際會議。會召開了專門討論下游加工過程的國際會議。 美國美國從從19811981年開始連續召開了生物產品回收的會議。年開始連續召開了生物產品回收的會議。 我國我國也于也于19891989年在濟南召開了一次專門會議。人們逐漸取得了共年在濟南召開了一次專門會議。人們逐漸取得了共 識；現代生物技術的發展是和下游技術的進步緊密相關的。識；現代生物技術的發展是和下游技術的進步緊密相關的。 二二 傳統生化產品和基因工程產品回收方法的比較傳統生化產品和基因工程產品回收方法的比較 1.1.生化產品的類型生化產品的類型 n按按用途用途分類分類 食品類。食品類。 保健品類。保健品類。 醫用類產

7、品（醫用類產品（19981998年，年，719719種）。抗生素種）。抗生素112112種種 農業用產品（農業用產品（19981998年，年，3636種）。種）。 生物試劑類（生物試劑類（19981998年，年，975975種）。種）。 n按按分子量分子量大小分類大小分類 Mass 1000DMass 1000DMass 1000D：酶、抗原、抗體、多肽、蛋白質類：酶、抗原、抗體、多肽、蛋白質類 n按發酵時目的按發酵時目的產物所在的位置產物所在的位置分類分類 cellcell內：胰島素、白細胞介素、干擾素、重組蛋白質內：胰島素、白細胞介素、干擾素、重組蛋白質 cellcell外：抗生素（青霉素

8、、紅霉素）、胞外酶（外：抗生素（青霉素、紅霉素）、胞外酶（-淀粉酶）淀粉酶） 2 2、傳統生化產品和基因工程產品在提取傳統生化產品和基因工程產品在提取 和精制上的差異和精制上的差異 傳統生化產品都為傳統生化產品都為小分子小分子( (工業用酶除外，工業用酶除外， 但它們對純度要求不高、提取方法較簡但它們對純度要求不高、提取方法較簡 單單) )其理化性能數據都為已知，因此放大其理化性能數據都為已知，因此放大 比較有根據；比較有根據； 基因工程產品大多為基因工程產品大多為大分子大分子，必要數據，必要數據 缺乏，放大多憑經驗。缺乏，放大多憑經驗。 由于第一代由于第一代基因工程產品基因工程產品都以都以E

9、.coliE.coli作作 為宿主，表達產品處于胞內，提取前需將為宿主，表達產品處于胞內，提取前需將 細胞破碎，細胞破碎，細胞內細胞內物質釋放出來，給提取物質釋放出來，給提取 增加了很多困難；增加了很多困難； 而發酵液中的產物，濃度較低，雜質又而發酵液中的產物，濃度較低，雜質又 多，且一般大分子較小分子不穩定多，且一般大分子較小分子不穩定( (易失活，易失活， 如對剪切力如對剪切力) )，故提取較困難。，故提取較困難。 大分子大分子( (蛋白質蛋白質) )的分離主要困難在于雜的分離主要困難在于雜 蛋白的分離，由于蛋白質都由氨基酸所構蛋白的分離，由于蛋白質都由氨基酸所構 成，所以性質相似，分離主

10、要依靠高分辨成，所以性質相似，分離主要依靠高分辨 力的精制方法，如色譜分離等。力的精制方法，如色譜分離等。 n含水多，產物含量低；含水多，產物含量低； n含菌體蛋白；含菌體蛋白； n溶有原來培養基成分；溶有原來培養基成分； n相當多的副產物、雜蛋白、毒素和色素；相當多的副產物、雜蛋白、毒素和色素； n易被雜菌污染或使產物進一步分解；易被雜菌污染或使產物進一步分解； n易起泡，粘性物質多。易起泡，粘性物質多。 1. 發酵液的特點發酵液的特點 1)1) 時間短；時間短； 2)2) 溫度低；溫度低； 3)3) pHpH適中（選擇在生物物質的溫度范圍內）；適中（選擇在生物物質的溫度范圍內）； 4)4)

11、 嚴格清洗消毒（包括廠房、設備及管路，注意死角），嚴格清洗消毒（包括廠房、設備及管路，注意死角）， 這和傳統產品抗生素的生產是一致的。這和傳統產品抗生素的生產是一致的。 對基因工程產品還應注意生物安全（對基因工程產品還應注意生物安全（biosafetybiosafety）問題，）問題， 要防止菌體擴散，一般要求在密封的環境下操作。要防止菌體擴散，一般要求在密封的環境下操作。 3 3 加工過程的特點加工過程的特點 1)1)應用面廣應用面廣。 醫藥衛生、環保、動植物生長醫藥衛生、環保、動植物生長 調節、食品和試劑等調節、食品和試劑等 2)2)種類繁多種類繁多。結構功能復雜，生物活性各異。結構功能復

12、雜，生物活性各異。 3)3)目的產物在初始物料中的含量低目的產物在初始物料中的含量低。 青霉素青霉素 （4.2%4.2%）、慶大霉素（）、慶大霉素（0.2%0.2%）、干擾素）、干擾素 （50ug/ml50ug/ml）。）。 4) )產品價格與產物濃度呈反比產品價格與產物濃度呈反比 原料中目標產物 濃度越低，所需 能耗越高，分離 過程成本越大。 5)5)初始物料成分復雜初始物料成分復雜, ,常需多個步驟常需多個步驟, ,產品總收率低。產品總收率低。 除少量產物外，還有大量的細胞及碎片、其他代除少量產物外，還有大量的細胞及碎片、其他代 謝物（幾百上千種）、培養基成分、無機鹽等。謝物（幾百上千種）

13、、培養基成分、無機鹽等。 i iT YY 6)6)生物活性物質的穩定性低。易變質、易失生物活性物質的穩定性低。易變質、易失 活、易變性，對溫度、活、易變性，對溫度、pHpH值、重金屬離子、值、重金屬離子、 有機溶劑、剪切力、表面張力等非常敏感。有機溶劑、剪切力、表面張力等非常敏感。 7)7)產品的質量要求高，尤其是藥品等。成品產品的質量要求高，尤其是藥品等。成品 青霉素對其強致敏原青霉素對其強致敏原 - - 青霉噻唑蛋白必青霉噻唑蛋白必 須控制須控制RIARIA值（放射免疫測定）小于值（放射免疫測定）小于100100 （1.51.5* *10-610-6），蛋白類藥物（雜質），蛋白類藥物（雜質

14、 2% 2%）、）、 重組胰島素中雜蛋白小于重組胰島素中雜蛋白小于0.01%0.01%。 四、生物技術下游加工過程的一般流程和單元操作四、生物技術下游加工過程的一般流程和單元操作 20世紀世紀80年代以來，生物工業下游技術進步很快，出現了很多年代以來，生物工業下游技術進步很快，出現了很多 新概念、新技術、新產品和新裝備。大致可分為以下幾大類：新概念、新技術、新產品和新裝備。大致可分為以下幾大類： （1）固液分離技術）固液分離技術 （2）細胞破碎技術）細胞破碎技術 （3）初步分離純化技術）初步分離純化技術 （4）高度分離純化技術）高度分離純化技術 （5）其他新型分離技術）其他新型分離技術 近近2

15、0年來，將在污水處理、化學工程和選礦工程上廣泛使用年來，將在污水處理、化學工程和選礦工程上廣泛使用 的絮凝技術引入到發酵液的預處理上，研究開發了菌體及懸的絮凝技術引入到發酵液的預處理上，研究開發了菌體及懸 浮物絮凝技術，改善了發酵液的分離性能，加之纖維素助濾浮物絮凝技術，改善了發酵液的分離性能，加之纖維素助濾 劑的開發，大大提高了發酵液的固液分離效率。在固液分離劑的開發，大大提高了發酵液的固液分離效率。在固液分離 機械方面，也出現了一些性能優良的新型機械，如帶式過濾機械方面，也出現了一些性能優良的新型機械，如帶式過濾 機、連續半連續板框過濾機、螺旋沉降式離心機等。微濾膜機、連續半連續板框過濾機

16、、螺旋沉降式離心機等。微濾膜 可高效分離細微的懸浮粒子。可高效分離細微的懸浮粒子。 （1）固液分離技術）固液分離技術 （2）細胞破碎技術）細胞破碎技術 （3）初步分離純化技術）初步分離純化技術 （4）高度分離純化技術）高度分離純化技術 （5）其他新型分離技術）其他新型分離技術 已開發出球磨破碎、壓力釋放破碎、冷凍加壓釋放破碎和化學已開發出球磨破碎、壓力釋放破碎、冷凍加壓釋放破碎和化學 破碎等技術。該技術的成熟使得胞內生物物質的大規模工業化破碎等技術。該技術的成熟使得胞內生物物質的大規模工業化 生產成為可能。生產成為可能。 （1）固液分離技術）固液分離技術 （2）細胞破碎技術）細胞破碎技術 （3

17、）初步分離純化技術）初步分離純化技術 （4）高度分離純化技術）高度分離純化技術 （5）其他新型分離技術）其他新型分離技術 主要開發了沉淀、離子交換、萃取、超濾等技術。較早出現主要開發了沉淀、離子交換、萃取、超濾等技術。較早出現 的是酶及蛋白質的鹽析法；有機溶劑沉淀法；雙水相萃取技的是酶及蛋白質的鹽析法；有機溶劑沉淀法；雙水相萃取技 術比較適合于胞內活性物質和細胞碎片的分離，為進一步純術比較適合于胞內活性物質和細胞碎片的分離，為進一步純 化精制創造了前提；超濾技術解決了生物大分子對化精制創造了前提；超濾技術解決了生物大分子對pH、熱、熱、 有機溶劑、金屬離子敏感等難題，在生物大分子的分級、濃有機

18、溶劑、金屬離子敏感等難題，在生物大分子的分級、濃 縮、脫鹽等操作中得到了廣泛的使用。縮、脫鹽等操作中得到了廣泛的使用。 （1）固液分離技術）固液分離技術 （2）細胞破碎技術）細胞破碎技術 （3）初步分離純化技術）初步分離純化技術 （4）高度分離純化技術）高度分離純化技術 （5）其他新型分離技術）其他新型分離技術 小分子物質一般可通過離子交換、脫色和結晶、重結晶等方小分子物質一般可通過離子交換、脫色和結晶、重結晶等方 法獲得純度很高的產品。生物大分子的純化一直是個難題。法獲得純度很高的產品。生物大分子的純化一直是個難題。 20世紀世紀70年代以來，逐漸開發出各種色譜（層析）技術，如年代以來，逐漸

19、開發出各種色譜（層析）技術，如 親和色譜、疏水色譜、聚焦色譜、離子交換色譜和凝膠色譜親和色譜、疏水色譜、聚焦色譜、離子交換色譜和凝膠色譜 等，后兩種技術已開始用于批量生產。等，后兩種技術已開始用于批量生產。 （1）固液分離技術）固液分離技術 （2）細胞破碎技術）細胞破碎技術 （3）初步分離純化技術）初步分離純化技術 （4）高度分離純化技術）高度分離純化技術 （5）其他新型分離技術）其他新型分離技術 超臨界超臨界CO2萃取技術在獲得天然生物物質方面有著獨特的萃取技術在獲得天然生物物質方面有著獨特的 優勢。優勢。20世紀世紀80年代以來，已經在許多領域中迅速實現了年代以來，已經在許多領域中迅速實現

20、了 工業化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分工業化。如啤酒花中有效成分和咖啡豆中咖啡因的萃取分 離。介于反滲透和超濾之間的納米濾（離。介于反滲透和超濾之間的納米濾（Nanofiltration）技）技 術，由于其能使水和大部分無機鹽通過而截留分子量術，由于其能使水和大部分無機鹽通過而截留分子量300- 1000u的小分子有機物，且操作壓力低，在生物工業和水處的小分子有機物，且操作壓力低，在生物工業和水處 理中具有廣闊的應用前景。滲透蒸發技術、液膜技術及反理中具有廣闊的應用前景。滲透蒸發技術、液膜技術及反 膠團技術的研究和應用開發等也相繼取得了很大的進展。膠團技術的研究和應用開發等也相

21、繼取得了很大的進展。 五、生物技術下游加工過程的五、生物技術下游加工過程的 一般流程和單元操作一般流程和單元操作 1) 培養液（發酵液）的預處理和固液分離；培養液（發酵液）的預處理和固液分離； 2) 初步純化（提取）；初步純化（提取）； 3) 高度純化（精制）；高度純化（精制）； 4) 成品加工。成品加工。 1. 一般下游加工過程可分為一般下游加工過程可分為4個階段個階段 2. 下游加工過程的一般流程 下游加工過程的一般流程 （沉淀、吸附、萃取、超濾、結晶）（沉淀、吸附、萃取、超濾、結晶） 發酵液發酵液 初步純化初步純化 細胞碎片分離細胞碎片分離 細胞破碎細胞破碎 細胞分離細胞分離 高度純化高

22、度純化 成品加工成品加工 預處理預處理 胞外產物胞外產物 （加熱、調（加熱、調pH、絮凝）、絮凝） （過濾、離心分離、膜分離（過濾、離心分離、膜分離) （勻漿、研磨、酶解）（勻漿、研磨、酶解） （離心分離、雙水相萃取、膜分離）（離心分離、雙水相萃取、膜分離） （重結晶、離子交換、色譜分離、膜分離）（重結晶、離子交換、色譜分離、膜分離） （濃縮、無菌過濾、干燥、成型）（濃縮、無菌過濾、干燥、成型） 胞外產物胞外產物 提取提取 精制精制 產品的收得率和質量控制產品的收得率和質量控制。 下游工藝過程決定于產品的性質和要求達到的純度下游工藝過程決定于產品的性質和要求達到的純度 n如產品為菌體本身，則工

23、藝比較簡單，只需經過濾、得到菌如產品為菌體本身，則工藝比較簡單，只需經過濾、得到菌 體，再經干燥就可，如單細胞蛋白的生產。體，再經干燥就可，如單細胞蛋白的生產。 n如可以從發酵液直接提取，則可省去固液分離步驟。如可以從發酵液直接提取，則可省去固液分離步驟。 n如為胞外產物則可省去細胞破碎步驟。如為胞外產物則可省去細胞破碎步驟。 六、六、 純化方法選擇的基本原則純化方法選擇的基本原則 1)1)盡可能簡單、低耗、高效、快速。盡可能簡單、低耗、高效、快速。 2)2)分離步驟盡可能少，每步收率盡可能高分離步驟盡可能少，每步收率盡可能高。 A)A)分離步驟越多，回收率越低；分離步驟越多，回收率越低； 如

24、如Y Y10 10 = 0.95 = 0.9510 10 = 0.63 = 0.63，Y Y5 5 = 0.95 = 0.955 5 =0.77 =0.77 B)B)分離步驟多，設備投入大，人員物資消耗大，分離步驟多，設備投入大，人員物資消耗大， 生產周期長生產周期長 i iT YY 九、九、目標蛋白質的表征和分析方法目標蛋白質的表征和分析方法 n 蛋白質在分離、純化過程個易發生變化，因此得到的產蛋白質在分離、純化過程個易發生變化，因此得到的產 品應與已知標準品對照，證明為同一物質并檢查其純度。品應與已知標準品對照，證明為同一物質并檢查其純度。 為達此目的，常需用幾種方法。為達此目的，常需用幾

25、種方法。 1 1、 HPLCHPLC選用基于個同原理的兩種層析系統選用基于個同原理的兩種層析系統( (如反相層析和如反相層析和 離子交換層析離子交換層析) )，如只得到單個對稱峰則表明純度較高；，如只得到單個對稱峰則表明純度較高； 1 1）聚丙烯酰胺凝膠電泳）聚丙烯酰胺凝膠電泳(PALE)(PALE)和等電聚焦；和等電聚焦； 2 2）順序分列）順序分列N N端和端和C C端順序分析可用來表征蛋白質：端順序分析可用來表征蛋白質： 3 3）其他分析，如氨基酸分析、肽圖、免疫化學分析等可進）其他分析，如氨基酸分析、肽圖、免疫化學分析等可進 一步提供產品純度達到均質一步提供產品純度達到均質(homog

26、eneity)(homogeneity)和標準品一致和標準品一致 的證明。的證明。 適合于大規模工業化生產的傳統技術經過改造提高后，適合于大規模工業化生產的傳統技術經過改造提高后， 適應面更寬，效率會更高，仍然顯示出強勁的生命力。適應面更寬，效率會更高，仍然顯示出強勁的生命力。 各種新型高效的過濾機械和離心機械的問世，結晶理各種新型高效的過濾機械和離心機械的問世，結晶理 論和離子交換技術的新進展，提高了產品的收率、質量論和離子交換技術的新進展，提高了產品的收率、質量 和生產效率。和生產效率。 十、生物工業下游技術的發展動態十、生物工業下游技術的發展動態 成本成本、質量質量、環保環保將是該技術發

27、展方向和動力將是該技術發展方向和動力 1. 傳統分離技術的提高和完善傳統分離技術的提高和完善 1）新型分離介質的研究開發）新型分離介質的研究開發 2）子代分離技術）子代分離技術 3）其他新興下游技術）其他新興下游技術 2. 新技術的研究開發新技術的研究開發 膜（膜材料和膜制造工藝）、樹脂（離子交換樹脂和大網格樹脂）和凝膜（膜材料和膜制造工藝）、樹脂（離子交換樹脂和大網格樹脂）和凝 膠（瓊脂糖凝膠為基質，與各種配基結合后制成各種色譜分離介質）是膠（瓊脂糖凝膠為基質，與各種配基結合后制成各種色譜分離介質）是 目前主要的新型分離介質。目前主要的新型分離介質。 各種分離純化技術相互結合、交叉、滲透，形

28、成子代分離技術。如膜技術和各種分離純化技術相互結合、交叉、滲透，形成子代分離技術。如膜技術和 萃取、蒸餾、蒸發技術相結合形成了膜萃取技術、膜蒸餾及滲透蒸發技術；萃取、蒸餾、蒸發技術相結合形成了膜萃取技術、膜蒸餾及滲透蒸發技術； 色譜技術與離子交換技術等結合形成了離子交換色譜、等電聚焦色譜等。色譜技術與離子交換技術等結合形成了離子交換色譜、等電聚焦色譜等。 由溶劑萃取技術衍生出一大批生物工業分離技術，如雙水相萃取、超臨界由溶劑萃取技術衍生出一大批生物工業分離技術，如雙水相萃取、超臨界COCO2 2 萃取、反膠團萃取（細胞碎片去除、細胞胞內物質、酶及蛋白質、天然生物萃取、反膠團萃取（細胞碎片去除、

29、細胞胞內物質、酶及蛋白質、天然生物 物質的提取分離）；菌體絮凝技術和菌體細胞破碎技術的進展為工業化經濟物質的提取分離）；菌體絮凝技術和菌體細胞破碎技術的進展為工業化經濟 地分離菌體細胞和大規模生產胞內物質創造了技術前提。地分離菌體細胞和大規模生產胞內物質創造了技術前提。 本章要求本章要求 n熟悉下游加工過程的重要性和特點熟悉下游加工過程的重要性和特點 n了解下游加工技術的發展過程了解下游加工技術的發展過程 n掌握下游加工過程的主要步驟和主要單元掌握下游加工過程的主要步驟和主要單元 操作操作 3 3 加工過程的特點加工過程的特點 1)1)應用面廣應用面廣。 醫藥衛生、環保、動植物生長醫藥衛生、環

30、保、動植物生長 調節、食品和試劑等調節、食品和試劑等 2)2)種類繁多種類繁多。結構功能復雜，生物活性各異。結構功能復雜，生物活性各異。 3)3)目的產物在初始物料中的含量低目的產物在初始物料中的含量低。 青霉素青霉素 （4.2%4.2%）、慶大霉素（）、慶大霉素（0.2%0.2%）、干擾素）、干擾素 （50ug/ml50ug/ml）。）。 5)5)初始物料成分復雜初始物料成分復雜, ,常需多個步驟常需多個步驟, ,產品總收率低。產品總收率低。 除少量產物外，還有大量的細胞及碎片、其他代除少量產物外，還有大量的細胞及碎片、其他代 謝物（幾百上千種）、培養基成分、無機鹽等。謝物（幾百上千種）、培養基成分、無機鹽等。 i iT YY 6)6)生物活性物質的穩定性低。易變質、易失生物活性物質的穩定性低。易變質、易失 活、易變性，對溫度、活、易變性，對溫度、pHpH值、重金屬離子、值、重金屬離子、 有機溶劑、剪切力、表面張力等非常敏感。有機溶劑、剪切力、表面張力等非常敏感。 7)7)產品的質量要求高，尤其是藥品等。成品產品的質量要求高，尤其是藥品等。成品 青霉素對其強致敏原青霉素對其強致敏原 - - 青霉噻唑蛋白必青霉噻唑蛋白必 須控制須控制RIARIA值（放射免疫測定）小于值（放射免疫測定）小