1、高速逆流色譜技術及應用領域高速逆流色譜技術及應用領域 上海同上海同 田生物技術田生物技術 報告內容報告內容 1 1 高速逆流色譜原理高速逆流色譜原理 2 2 高速逆流色譜優點高速逆流色譜優點 3 3 高速逆流色譜應用高速逆流色譜應用 4 4 關于上海同田生物關于上海同田生物 1.1.高速逆流色譜原理高速逆流色譜原理 液液分配色譜液液分配色譜 利用一種特殊的流體動力學現象使互不混溶的利用一種特殊的流體動力學現象使互不混溶的兩相溶兩相溶 劑劑( (固定相和流動相固定相和流動相) )在在螺旋管螺旋管中高效中高效地地接觸、混合、接觸、混合、 分配和傳遞分配和傳遞 其中固定相以一種相對均勻的方式分布在一

2、根聚四氟其中固定相以一種相對均勻的方式分布在一根聚四氟 乙烯管繞成的螺旋管中乙烯管繞成的螺旋管中 流動相以一定的速度通過固定相，并按照被分離物質流動相以一定的速度通過固定相，并按照被分離物質 分配系數的不同依次洗脫而獲得分離分配系數的不同依次洗脫而獲得分離 特殊的流體動力學？特殊的流體動力學？ 固定相的保留固定相的保留 利用螺旋管的方向性和同步行星式運動產生的二維利用螺旋管的方向性和同步行星式運動產生的二維 離心力場形成的單向性流體動力學平衡（離心力場形成的單向性流體動力學平衡（HDES） 從而實現流動相高速移動時固定相的保留從而實現流動相高速移動時固定相的保留 混合區：混合區：在靠近離心軸在

3、靠近離心軸 心大約有四分之一的區心大約有四分之一的區 域，兩相的激烈混合域，兩相的激烈混合 靜置區：靜置區：兩相溶劑分成兩相溶劑分成 兩層，重相在外部，輕兩層，重相在外部，輕 相在內部相在內部 以以1000轉轉/ /分的速率進行旋分的速率進行旋 轉，在二維力場的作用下轉，在二維力場的作用下 分離管柱內混合和傳遞的分離管柱內混合和傳遞的 頻率可達到頻率可達到1717次次/S/S，從而，從而 實現高效的分離實現高效的分離 K Cs/Cm Cs Cm HSCCC的工作流程的工作流程 2.2.高速逆流色譜優點高速逆流色譜優點 不用固態載體的高效液不用固態載體的高效液- -液分配色譜技術液分配色譜技術

4、不存在樣品的不可逆吸附，理論回收率不存在樣品的不可逆吸附，理論回收率100% 樣品負載能力強，制備量大，重現性好樣品負載能力強，制備量大，重現性好 操作成本低，無制備柱消耗，后續投入較低操作成本低，無制備柱消耗，后續投入較低 可采用廣泛的溶劑體系和多樣性的操作條件可采用廣泛的溶劑體系和多樣性的操作條件 操作簡單，無需太多樣品前處理操作簡單，無需太多樣品前處理 3.3.高速逆流色譜應用高速逆流色譜應用 高速逆流色譜技術的應用領域高速逆流色譜技術的應用領域 1 高速逆流色譜在中藥現代化中的應用高速逆流色譜在中藥現代化中的應用 2 高速逆流色譜在抗生素分離純化中的應用高速逆流色譜在抗生素分離純化中的

5、應用 3 高速逆流色譜在異構體分離純化中的應用高速逆流色譜在異構體分離純化中的應用 4 高速逆流色譜在食品行業中的應用高速逆流色譜在食品行業中的應用 5 高速逆流色譜在化學合成中的應用高速逆流色譜在化學合成中的應用 6 高速逆流色譜在生物領域中的應用高速逆流色譜在生物領域中的應用 7 高速逆流色譜在發酵產物分離純化中的應用高速逆流色譜在發酵產物分離純化中的應用 成藥質量控制成藥質量控制 指紋圖譜指紋圖譜 指導原藥材種植指導原藥材種植/ GAP基地建設基地建設 單體化合物單體化合物 用于制藥中間體的質用于制藥中間體的質 量控制量控制 實例實例1 1 大黃有效成分的分離大黃有效成分的分離 0100

6、200300400500 200 400 600 800 1000 VI VIVIIIIII Absorbance(mV) Time/min 010203040 0 100 200 300 400 500 600 physcion chrysophanol emodin rhein aloe-emodin cinnamic acid Absorbance(mAU) Time/min HSCCC條件：條件： 固定相：乙醚固定相：乙醚 流動相：流動相：1%NaH2PO4-1%NaOH 梯度梯度 洗脫洗脫(500min內內,由由100:0-0:100) 流速流速: 2.0 ml min-1 轉速：轉

7、速：800 rpm 樣品量：樣品量：120 mg 粗提物粗提物 固定相保留：固定相保留：40% 機型：機型：TBE-300A ：rhein（大黃酸）（大黃酸）19 mg : cinnamic acid（苯乙烯酸）（苯乙烯酸）19 mg : emodin（大黃素）（大黃素）18 mg : aloe-emodin（蘆薈大黃素）（蘆薈大黃素）14 mg : chrysophanol （大黃酚）（大黃酚）10 mg : physcion（大黃素甲醚）（大黃素甲醚）6 mg 純度均在純度均在98以上以上 Journal of Chromatography A,2004,Volume 1052, Issu

8、es 1-2, Pages 217-221 HSCCCHSCCC在分離中藥單體中的應用（蒽醌類）在分離中藥單體中的應用（蒽醌類） 實例實例2 2 蛇床子有效成分的分離蛇床子有效成分的分離 HSCCC條件：條件： 溶劑系統溶劑系統: 石油醚石油醚-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水 流動相：梯度洗脫流動相：梯度洗脫 0-150 min:5:5:5:5下相下相 150-250 min:5:5:6:4下相下相 250 min后后: 5:5:6.5:3.5下相下相 流速流速: 2.0 ml min-1 轉速：轉速：800 rpm 樣品量：樣品量：150 mg 粗提物粗提物 機型：機型：TBE-300A

9、固定相保留：固定相保留： 60% ：花椒毒素花椒毒素 95.0 7.6 mg : 異茴芹素異茴芹素 99.6 7.6 mg : 佛手苷內酯佛手苷內酯 99.7 9.7 mg : 歐前胡素歐前胡素 100 60.5 mg : 蛇床子素蛇床子素 100 50.6 mg :未知化合物未知化合物 98.1 10.2 mg 05101520253035 0 200 400 600 800 Unknown Osthole Imperatorin Bergapten Isopimpinellin Xanthotoxin Asorbance (mAU) Time (min) 0100200300400500

10、200 400 600 800 1000 VIVIVIIIIII Absorbance (mV) Time (min) Journal of Chromatography A, 2004, Volume 1055, Issues 1-2, 71-76 HSCCCHSCCC在分離中藥單體中的應用（香豆素類）在分離中藥單體中的應用（香豆素類） Journal of Chromatography A,1102(2006)44-50 實例實例3 3 白花敗醬異戊烯基黃酮的分離白花敗醬異戊烯基黃酮的分離 溶劑系統溶劑系統: 正己烷正己烷-乙酸乙酯甲醇乙酸乙酯甲醇-水水 (5:6:6:6) 流動相：下相流

11、動相：下相 流速流速: 1.0-2.0 ml min-1 轉速：轉速：850 rpm 樣品量：樣品量：400 mg 粗提物粗提物 固定相保留：固定相保留： 65% 分離溫度分離溫度: 25 C 機型：機型：TBE-300A : orotinin （牡荊苷）（牡荊苷）99.2 38.2 mg : orotinin-5-methyl ether 98.5 19.8 mg : licoagroachalcone B 97.6 21.5 mg HSCCCHSCCC在分離中藥單體中的應用在分離中藥單體中的應用( (黃酮類黃酮類) ) 實例實例4 4 吳茱萸生物堿的分離吳茱萸生物堿的分離 溶劑系統溶劑系統

12、: 正己烷正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-水水 (5:5:7:5) 流速流速: 2.0 ml/min 轉速：轉速：900 rpm 樣品量：樣品量：180 mg 粗提物粗提物 固定相保留：固定相保留：50% 機型：機型：TBE-300A :吳茱萸堿吳茱萸堿 98.7 28 mg :吳茱萸次堿吳茱萸次堿 98.4 19 mg :吳茱萸新堿吳茱萸新堿 96.9 21 mg : 1-methy-2-(6Z,9Z)-6,9- pentadecadienyl-4-(1H)-quinolone. 98.0 16 mg : 1-methyl-2-dodecyl-4-(1H)- quinolone 97.2

13、 12 mg 0102030405060 0 200 400 600 800 A 1-Methyl-2-dodecyl- 4-(1H)-quinolone 1-Methy-2-(6Z,9Z)-6,9- pentadecadienyl -4-(1H)-quinolone Evocarpine Rutaecarpine Evodiamine Absorbance (mAU) / 254 nm Time (min) 0100200300400500600 200 400 600 800 1000 VIVIIIIII Absorbance (mV) / 254 nm Time (min) J. Chr

14、omatogr. A, 2005, vol 1074/1-2 pp. 139-144 HSCCCHSCCC在分離中藥單體中的應用（生物堿類）在分離中藥單體中的應用（生物堿類） 蘆薈苷蘆薈苷B 蘆薈苷蘆薈苷A 蘆薈未知物蘆薈未知物 蘆薈提取物蘆薈提取物HSCCC分離圖譜分離圖譜 丹參提取物的丹參提取物的HSCCC分離圖譜分離圖譜 丹酚酸丹酚酸 B B 沙棘提取物的沙棘提取物的HSCCC圖譜圖譜 異鼠李素異鼠李素 山奈酚山奈酚 槲皮素槲皮素 -10.000 33.600 77.200 120.800 164.400 208.000 0.0024.0048.0072.0096.00120.00144

15、.00 168.00192.00 216.00240.00 mv min 高車前素高車前素 未知物未知物 澤蘭黃酮澤蘭黃酮 荔枝草提取物的荔枝草提取物的HSCCC圖譜圖譜 小結：小結： HSCCC在中藥中各類單體的制備均有應用，經在中藥中各類單體的制備均有應用，經 過簡單的前處理（提取、萃取或大孔樹脂柱）后過簡單的前處理（提取、萃取或大孔樹脂柱）后 直接上樣，一次分離就能得到高純度和高得率的直接上樣，一次分離就能得到高純度和高得率的 單體，已成為天然產物分離純化中有效的不可替單體，已成為天然產物分離純化中有效的不可替 代的分離方法。代的分離方法。 HSCCCHSCCC在中藥指紋圖譜中的應用在中

16、藥指紋圖譜中的應用 中藥指紋圖系指中藥經適當處理后，采用一定的分析手段（光中藥指紋圖系指中藥經適當處理后，采用一定的分析手段（光 譜和色譜）得到的能夠標示該中藥特性的共有峰的圖譜譜和色譜）得到的能夠標示該中藥特性的共有峰的圖譜 中藥成分復雜，指紋圖譜是中藥質量控制的有效方法中藥成分復雜，指紋圖譜是中藥質量控制的有效方法 20002000年年8 8月國家藥品監督管理局規定中藥注射劑必須建立藥材月國家藥品監督管理局規定中藥注射劑必須建立藥材 和制劑的指紋圖譜標準，美國和制劑的指紋圖譜標準，美國FDA及歐共體藥審委也要求采用及歐共體藥審委也要求采用 指紋圖譜技術指紋圖譜技術 色譜法是指紋圖譜的首選，

17、傳統的色譜指紋圖譜方法存在缺陷色譜法是指紋圖譜的首選，傳統的色譜指紋圖譜方法存在缺陷 （比如（比如HPLCHPLC法前處理要求嚴格，會有死吸附或樣品的變性，對法前處理要求嚴格，會有死吸附或樣品的變性，對 有些樣品不能準確反應其特征）有些樣品不能準確反應其特征） 高速逆流色譜法是中藥指紋圖譜發展的一個新方向高速逆流色譜法是中藥指紋圖譜發展的一個新方向 0 20 40 60 80 100 120 140 01234567891011121314 Time (h) Absorbance (OD280nm) 010203040 0 100 200 mAU (280nm) Time (min) 0102

18、03040 0 40 80 120 160 mAU (280nm) Time (min) 010203040 0 100 200 mAU (280nm) Time (min) B1 B2 B3 0 50 100 150 200 250 01234567891011121314 Time (h) Absorbance (OD280nm) 0 20 40 60 80 100 01234567891011121314 Time (h) Absorbance (OD280nm) A1 A2 A3 HSCCCHSCCC圖譜圖譜 HPLCHPLC圖譜圖譜 不同產地丹參提取物不同產地丹參提取物 實例實例 溶

19、劑體系：石油醚溶劑體系：石油醚-丙酮丙酮-水水 （3:3:2,v/v） 樣品：樣品：250mg 環孢菌素粗品環孢菌素粗品 檢測條件：檢測條件：ELSD 環孢菌素環孢菌素 A98.6%， 90.2%(收率收率) 環孢菌素環孢菌素 C99.3， 85.0%(收率收率) 環孢菌素環孢菌素 B98.7， 88.5%(收率收率) 環孢菌素環孢菌素 D98.5， 86.3%(收率收率) 實例實例1 1 環孢菌素粗品環孢菌素粗品 HSCCC在抗生素分離純化中的應用在抗生素分離純化中的應用 溶劑體系：正己烷溶劑體系：正己烷-乙酸乙酯乙酸乙酯-甲醇甲醇-0.5氨水（氨水（3:7:5:6,V/V），）， 檢測器：

20、檢測器：ELSD；進樣量：；進樣量：300mg 紅霉素紅霉素A和和C含量均在含量均在98以上以上 實例實例2 2 紅霉素紅霉素 HSCCC在抗生素分離純化中的應用在抗生素分離純化中的應用 實例實例1 1 藤黃酸異構體的分離藤黃酸異構體的分離 溶劑系統溶劑系統: 正己烷正己烷-甲醇甲醇-水水 (5:4:1) 流動相：下相流動相：下相 流速流速: 2.0 ml min-1 轉速：轉速：900 rpm 樣品量：樣品量：50 mg 固定相保留：固定相保留： 50% 分離溫度分離溫度: 25 C A. gambolic acid 97.2% B. epigambolic acid 97.5% 閉合回路系

21、統閉合回路系統 Journal of Chromatography A, 2006, Volume 1127, 298-301 HSCCCHSCCC在異構體分離純化中的應用在異構體分離純化中的應用 實例實例1 1 利用利用HSCCCHSCCC分離標準蛋白質混合物分離標準蛋白質混合物 0100200300 0 2 4 6 8 Signal (mV) Time (min) 1 2 3 溶劑體系：溶劑體系：PEG1000-PEG1000-磷酸鹽體系磷酸鹽體系- -水水14-16-70(%,w/w)14-16-70(%,w/w) 樣品：樣品：1mg 1mg 細胞色素細胞色素C C、 20mg 20mg

22、 溶菌酶、溶菌酶、5mg 5mg 血紅蛋白血紅蛋白 1 1. .Cytochrome C; Cytochrome C; 2.Lysozyme ; 2.Lysozyme ; 3.Hemoglobin 3.Hemoglobin ( (反轉出峰，上相為流反轉出峰，上相為流 動相動相) ) 色譜，色譜，2005,Vol.23 No.1 122005,Vol.23 No.1 121717 HSCCC在蛋白質分離純化中的應用在蛋白質分離純化中的應用 溶劑體系：溶劑體系：PEG1000-PEG1000-磷酸二氫鉀磷酸二氫鉀- -水水15-17-68(%,w/w)15-17-68(%,w/w) 樣品：樣品：1

23、mg 1mg 細胞色素細胞色素C C、8mg 8mg 肌紅蛋白、肌紅蛋白、20mg20mg溶菌酶溶菌酶 1.Cytochrome C; 2.Myoglobin 3.Lysozyme 實例實例2 2 利用利用HSCCCHSCCC分離標準蛋白質混合物分離標準蛋白質混合物 HSCCC在蛋白質分離純化中的應用在蛋白質分離純化中的應用 從上面這些實例可以看出，從上面這些實例可以看出，HSCCCHSCCC作為作為 一種高效的液液分配色譜，擁有廣闊的一種高效的液液分配色譜，擁有廣闊的 應用空間。應用空間。 4.4.關于上海同田生物技術關于上海同田生物技術 公司位于上海張江科技園，占地約公司位于上海張江科技園

24、，占地約3030畝，建筑面畝，建筑面 積約積約2000020000平方米，總投資人民幣平方米，總投資人民幣60006000萬元。萬元。 2008 2008年年1111月月2525日，上海市高新技術企業認定辦公日，上海市高新技術企業認定辦公 室公告，上海同田生物技術被認定為上海市室公告，上海同田生物技術被認定為上海市20082008年第年第 一批高新技術企業。一批高新技術企業。 公司致力于高速逆流色譜儀（公司致力于高速逆流色譜儀（HSCCC）、）、 高純度天然產物有效成分單體、天然藥物原料高純度天然產物有效成分單體、天然藥物原料/ / 中間體的研究開發、生產和銷售。中間體的研究開發、生產和銷售。

25、 作為多分離柱高速逆流色譜儀國家 新型專利的擁有者、高速逆流色譜領域 的領導者，我們與通用電氣醫療生物科 學中國（GE Healthcare Bio-sciences co., ltd .）建立了長期的合作伙伴關系。 TBE300BKTA Prime 在高速逆流色譜技術領域，公司所研制并批量生在高速逆流色譜技術領域，公司所研制并批量生 產擁有自主知識產權的新型多分離柱高速逆流色譜儀，產擁有自主知識產權的新型多分離柱高速逆流色譜儀， 性能穩定可靠，有分析型、半制備型、制備型等性能穩定可靠，有分析型、半制備型、制備型等7 7種種 不同產品：不同產品： 國內部分代表客戶名單：國內部分代表客戶名單： 香港賽馬會中藥研究