1、目錄目錄 第十四章第十四章 DNA的生物合成的生物合成 DNA Biosynthesis ( Replication ) 目錄目錄 復制復制(replication) 是以是以DNA為模板的為模板的DNA 合成，是基因組的復制過程。在這個過程中，合成，是基因組的復制過程。在這個過程中， 親代親代DNA作為合成模板，按照堿基配對原則作為合成模板，按照堿基配對原則 合成子代分子，其化學本質是酶促脫氧核苷酸合成子代分子，其化學本質是酶促脫氧核苷酸 聚合反應。聚合反應。 復制復制 親代親代DNA 子代子代DNA 目錄目錄 n本章主要內容：本章主要內容： DNA DNA復制的基本特征復制的基本特征 DN

2、A復制的酶學和拓撲學變化復制的酶學和拓撲學變化 原核生物原核生物DNADNA復制過程復制過程 真核生物真核生物DNADNA生物合成過程生物合成過程 逆轉錄和其他復制方式逆轉錄和其他復制方式 DNA復制的基本特征復制的基本特征 Basic Rules of DNA Replication 第第 一一 節(jié)節(jié) 目錄目錄 半保留復制半保留復制(semi-conservative replication) 雙向復制雙向復制(bidirectional replication) 半不連續(xù)復制半不連續(xù)復制(semi-discontinuous replication) nDNA復制的主要特征復制的主要特征

3、目錄目錄 一、一、 DNA以半保留方式進行復制以半保留方式進行復制 DNA生物合成時，母鏈生物合成時，母鏈DNA解開為兩解開為兩 股單鏈，各自作為模板股單鏈，各自作為模板(template)按堿基配按堿基配 對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細對規(guī)律，合成與模板互補的子鏈。子代細 胞的胞的DNA，一股單鏈從親代完整地接受過，一股單鏈從親代完整地接受過 來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子來，另一股單鏈則完全從新合成。兩個子 細胞的細胞的DNA都和親代都和親代DNA堿基序列一致。堿基序列一致。 這種復制方式稱為這種復制方式稱為半保留復制半保留復制。 n半保留復制半保留復制的概念的概念: : 目錄

4、目錄 n子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式子鏈繼承母鏈遺傳信息的幾種可能方式: : 全保留式全保留式 半保留式半保留式 混合式混合式 n密度梯度實驗密度梯度實驗: : 實驗結果支持實驗結果支持半保留復制半保留復制的設想。的設想。 含含15N-DNA的細菌的細菌 培養(yǎng)于普培養(yǎng)于普 通培養(yǎng)液通培養(yǎng)液 第一代第一代 繼續(xù)培養(yǎng)于繼續(xù)培養(yǎng)于 普通培養(yǎng)液普通培養(yǎng)液 第二代第二代 梯度離心結果梯度離心結果 目錄目錄 按半保留復制方式，子代按半保留復制方式，子代DNA與親代與親代DNA A 的的堿基序列一致堿基序列一致，即子代保留了親代的全部遺，即子代保留了親代的全部遺 傳信息，體現(xiàn)了遺傳的傳信息，體現(xiàn)了遺傳

5、的保守性保守性。 n半保留復制的意義半保留復制的意義: : 遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎，遺傳的保守性，是物種穩(wěn)定性的分子基礎， 但但不是絕對的不是絕對的。 目錄目錄 A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C C C A C T G G G G T G A C C A G G T A C T G T C C A T G A C T C C A T G A C A G G T A C T G A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C

6、A G G T A C T G C C A C T G G T C C A T G A C G G T G A C C + 母鏈母鏈DNA復制過程中形成復制過程中形成 的復制叉的復制叉 子代子代DNA 目錄目錄 原核生物基因組是環(huán)狀原核生物基因組是環(huán)狀DNA，只有一個，只有一個復制起復制起 點（點（origin）。復制從起點開始，向兩個方向。復制從起點開始，向兩個方向 進行解鏈，進行的是單點起始進行解鏈，進行的是單點起始雙向復制雙向復制。 二、二、DNA復制從起點向兩個方向延伸復制從起點向兩個方向延伸 復制中的放射自顯影圖象復制中的放射自顯影圖象 A. 環(huán)狀雙鏈環(huán)狀雙鏈DNA及復制起始點及復制

7、起始點 B. 復制中的兩個復制叉復制中的兩個復制叉 C. 復制接近終止點復制接近終止點(termination, ter) ori ter A B C 目錄目錄 真核生物每個染色體有多個起始點，是多復真核生物每個染色體有多個起始點，是多復 制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間制子的復制。習慣上把兩個相鄰起始點之間 的距離定為一個的距離定為一個復制子復制子(replicon) 。復制子是。復制子是 獨立完成復制的功能單位。獨立完成復制的功能單位。 5 3 oriorioriori 5 3 5 3 oriorioriori 5 3 5 5 3 3 5 5 3 復制復制 3 目錄目錄 三、三、DN

8、A復制反應呈半不連續(xù)特征復制反應呈半不連續(xù)特征 3 5 3 5 解鏈方向解鏈方向 3 5 3 3 5 領頭鏈領頭鏈 (leading strand) 后隨鏈后隨鏈 (lagging strand) 目錄目錄 順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的，順著解鏈方向生成的子鏈，復制是連續(xù)進行的， 這股鏈稱為這股鏈稱為領頭鏈領頭鏈(leading strand) 。 另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不另一股鏈因為復制的方向與解鏈方向相反，不 能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的能順著解鏈方向連續(xù)延長，這股不連續(xù)復制的 鏈稱為鏈稱為后隨鏈后隨鏈(lagging strand) 。復制中的不連

9、。復制中的不連 續(xù)片段稱為續(xù)片段稱為岡崎片段岡崎片段(okazaki fragment)。 領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復領頭鏈連續(xù)復制而隨從鏈不連續(xù)復制，就是復 制的半不連續(xù)性。制的半不連續(xù)性。 目錄目錄 DNA復制的酶學和拓撲學變化復制的酶學和拓撲學變化 第第 二二 節(jié)節(jié) The Enzymology and Topology of DNA Replication 目錄目錄 n參與參與DNA復制的物質復制的物質: 底物底物(substrate): dATP, dGTP, dCTP, dTTP； 聚合酶聚合酶(polymerase): 依賴依賴DNA的的DNA聚合酶，聚合酶， 簡寫

10、為簡寫為 DNA-pol； 模板模板(template): 解開成單鏈的解開成單鏈的DNA母鏈；母鏈； 引物引物(primer): 提供提供3 -OH末端使末端使dNTP可以依次可以依次 聚合；聚合； 其他的其他的酶和蛋白質因子酶和蛋白質因子。 目錄目錄 (dNMP)n + dNTP (dNMP)n+1 + PPi RNA引物引物 RNA引物引物 子代子代DNA 目錄目錄 n聚合反應的特點聚合反應的特點: : DNA 新鏈生成需新鏈生成需RNA引物引物和和模板模板； 新鏈的延長只可沿新鏈的延長只可沿5 3 方向進行。方向進行。 目錄目錄 一、一、DNA聚合酶催化脫氧核苷酸間的聚合聚合酶催化脫氧

11、核苷酸間的聚合 全稱：全稱：依賴依賴DNA的的DNA聚合酶聚合酶 (DNA-dependent DNA polymerase) 簡稱：簡稱：DNA-pol 活性：活性： 1. 53 的聚合活性的聚合活性 2. 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 5 A G C T T C A G G A T A 3 | | | | | | | | | | | 3 T C G A A G T C C T A G C G A C 5 3 5 外切酶活性外切酶活性: 5 3 外切酶活性外切酶活性: ? 能切除突變的能切除突變的 DNA片段。片段。 能辨認錯配的堿基對，并將其水解。能辨認錯配的堿基對，并將其水解。 n核酸外

12、切酶活性核酸外切酶活性: : 目錄目錄 （一）原核生物有（一）原核生物有3種種DNA聚合酶聚合酶 DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目錄目錄 原核生物的原核生物的DNADNA聚合酶聚合酶 可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性 無無無無有有5 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 20？400分子數(shù)分子數(shù)/細胞細胞 多亞基不對稱多亞基不對稱 二聚體二聚體 ？單肽鏈單肽鏈組成組成 250120109分子量分子量(kD) DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 可能可能不可能不可能可能可能基因突變后的致死性基因突變后的致死性 無無無無有有5

13、 3 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 20？400分子數(shù)分子數(shù)/細胞細胞 多亞基不對稱多亞基不對稱 二聚體二聚體 ？單肽鏈單肽鏈組成組成 250120109分子量分子量(kD) DNA-pol IIIDNA-pol IIDNA-pol I 目錄目錄 個核心酶個核心酶 1個個 -復合物（復合物（ 、 、 、 、 、 6種亞種亞 基）基） 1對對 -亞基（可滑動亞基（可滑動 的的DNA夾子）夾子） DNA聚合酶聚合酶全酶結構全酶結構 全酶結構包括：全酶結構包括： 目錄目錄 亞基亞基（130 000）主要功能是合成）主要功能是合成DNA 亞基亞基具有具有35 外切酶活性（復制保真性外切酶活性（復制保真

14、性 所必需）所必需） 亞基可增強其活性亞基可增強其活性 亞基亞基可能起組裝作用可能起組裝作用 核心酶由核心酶由 、 和和 亞基組成：亞基組成： 兩側的兩側的 亞基發(fā)揮夾穩(wěn)亞基發(fā)揮夾穩(wěn)DNADNA模板鏈，并使酶沿模模板鏈，并使酶沿模 板滑動的作用板滑動的作用 目錄目錄 2個個 -亞基亞基分別和分別和1個核心酶相互作用，其個核心酶相互作用，其 柔性連接區(qū)可以確保在復制叉柔性連接區(qū)可以確保在復制叉1個全酶分子的個全酶分子的 2個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責合成個核心酶能夠相對獨立運動，分別負責合成 前導鏈和后隨鏈。前導鏈和后隨鏈。 功能：功能：有促進全酶組裝至模板上及增強核心酶有促進全酶組裝至模

15、板上及增強核心酶 活性的作用活性的作用 -復合物由復合物由6種亞基組成：種亞基組成： 、 、 、 、 、 目錄目錄 n功能：功能： DNA-pol （109kD） 對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復對復制中的錯誤進行校讀，對復制和修復 中出現(xiàn)的空隙進行填補。中出現(xiàn)的空隙進行填補。 目錄目錄 323個氨基酸個氨基酸 小片段小片段 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 大片段大片段/Klenow 片段片段 604個氨基酸個氨基酸 DNA聚合酶活性聚合酶活性 5 核酸外切酶活性核酸外切酶活性 N 端端 C 端端 木瓜蛋白酶木瓜蛋白酶 DNA-pol Klenow片段是實驗室合成片段是實驗室合成DNA，

16、進行，進行 分子生物學研究中常用的工具酶。分子生物學研究中常用的工具酶。 目錄目錄 DNA-pol （120kD） DNA-pol II基因發(fā)生突變，細菌依然能存活?；虬l(fā)生突變，細菌依然能存活。 DNA-pol 對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生對模板的特異性不高，即使在已發(fā)生 損傷的損傷的DNA模板上，它也能催化核苷酸聚合。因模板上，它也能催化核苷酸聚合。因 此認為，它參與此認為，它參與DNA損傷的應急狀態(tài)修復。損傷的應急狀態(tài)修復。 目錄目錄 （二）常見的真核細胞（二）常見的真核細胞DNA聚合酶有聚合酶有5種種 DNA-pol 起始引發(fā)，有引物酶活性。起始引發(fā)，有引物酶活性。 延長子鏈的主要

17、酶，有解螺旋酶活性。延長子鏈的主要酶，有解螺旋酶活性。 參與低保真度的復制參與低保真度的復制 。 在復制過程中起校讀、修復和填補缺在復制過程中起校讀、修復和填補缺 口的作用。口的作用。 在線粒體在線粒體DNA復制中起催化作用。復制中起催化作用。 DNA-pol DNA-pol DNA-pol DNA-pol 目錄目錄 真核生物和原核生物真核生物和原核生物DNA聚合酶的比較聚合酶的比較 E.Coli真核細胞真核細胞 功能功能 填補復制中的填補復制中的DNA空隙，空隙，DNA修復和修復和 重組重組 復制中的校對，復制中的校對，DNA修復修復 DNA修復修復 線粒體線粒體DNA合成合成 前導鏈合成前

18、導鏈合成 DnaG 引物酶引物酶 后隨鏈合成后隨鏈合成 目錄目錄 真核生物的真核生物的DNA聚合酶聚合酶 填填補補引引物物 空空隙隙，切切 除除修修復復， 重重組組 延延長長子子 鏈鏈的的主主 要要酶酶， 解解螺螺旋旋 酶酶活活性性 線線粒粒體體 DNA復復 制制 低低保保 真真度度 的的復復 制制 起起始始引引 發(fā)發(fā)，引引 物物酶酶活活 性性 功功能能 +- 3 5 核核酸酸外外切切 酶酶活活性性 高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性 25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD） DNA-pol 填填補補引引物物 空空隙隙，切切 除除修修復復， 重重組組 延延長長子子 鏈

19、鏈的的主主 要要酶酶， 解解螺螺旋旋 酶酶活活性性 線線粒粒體體 DNA復復 制制 低低保保 真真度度 的的復復 制制 起起始始引引 發(fā)發(fā)，引引 物物酶酶活活 性性 功功能能 +- 3 5 核核酸酸外外切切 酶酶活活性性 高高高高高高？中中5 3 聚聚合合活活性性 25.512.514.04.016.5分分子子量量（kD） DNA-pol 目錄目錄 二、二、DNA聚合酶的堿基選擇和校對功聚合酶的堿基選擇和校對功 能實現(xiàn)復制的保真性能實現(xiàn)復制的保真性 復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能復制按照堿基配對規(guī)律進行，是遺傳信息能 準確傳代的基本原理。準確傳代的基本原理。 此外還需酶學的機制來保證復

20、制的保真性。此外還需酶學的機制來保證復制的保真性。 目錄目錄 遵守嚴格的堿基配對規(guī)律；遵守嚴格的堿基配對規(guī)律； 聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能；聚合酶在復制延長時對堿基的選擇功能； 復制出錯時有即時校對功能。復制出錯時有即時校對功能。 nDNA復制的保真性至少要依賴三種機制：復制的保真性至少要依賴三種機制： 目錄目錄 （一）復制的保真性依賴正確的堿基選擇（一）復制的保真性依賴正確的堿基選擇 利用利用“錯配錯配”實驗發(fā)現(xiàn)，實驗發(fā)現(xiàn)，DNA pol DNA pol 對核苷酸的對核苷酸的 參入（參入（incorporationincorporation）具有選擇功能。）具有選擇功能。 DNA p

21、ol DNA pol 對嘌呤的不同構型表現(xiàn)不同親和力，對嘌呤的不同構型表現(xiàn)不同親和力， 因此實現(xiàn)其選擇功能。因此實現(xiàn)其選擇功能。 目錄目錄 （二）聚合酶中的核酸外切酶活性在復制中辨（二）聚合酶中的核酸外切酶活性在復制中辨 認切除錯配堿基并加以校正認切除錯配堿基并加以校正 目錄目錄 A：DNA-pol的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活的外切酶活性切除錯配堿基；并用其聚合活 性摻入正確配對的底物。性摻入正確配對的底物。 B：堿基配對正確，：堿基配對正確， DNA-pol不表現(xiàn)活性。不表現(xiàn)活性。 DNA pol 的校讀功能的校讀功能 目錄目錄 三、復制中的解鏈伴有三、復制中的解鏈伴有DNA 分子

22、分子 拓撲學變化拓撲學變化 DNA分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把分子的堿基埋在雙螺旋內部，只有把 DNA解成單鏈，它才能起模板作用。解成單鏈，它才能起模板作用。 目錄目錄 （一）多種酶參與（一）多種酶參與DNA解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài)解鏈和穩(wěn)定單鏈狀態(tài) 理順理順DNA鏈鏈拓撲異構酶拓撲異構酶 (gyrA, B) 穩(wěn)定已解開的單鏈穩(wěn)定已解開的單鏈單鏈單鏈DNA 結合蛋白結合蛋白 SSB 催化催化RNA引物生成引物生成引物酶引物酶DnaG (dnaG) 運送和協(xié)同運送和協(xié)同DnaB DnaC (dnaC) 解開解開DNA雙鏈雙鏈 解螺旋酶解螺旋酶DnaB (dnaB) 辨認起始點辨認起始點 DnaA

23、(dnaA) 蛋白質（基因）蛋白質（基因）通用名通用名功能功能 原核生物復制起始的相關蛋白質原核生物復制起始的相關蛋白質 目錄目錄 E. Coli 基因圖基因圖 目錄目錄 解螺旋酶解螺旋酶(helicase)利用利用ATP供能，作用于供能，作用于 氫鍵，使氫鍵，使DNA雙鏈解開成為兩條單鏈。雙鏈解開成為兩條單鏈。 引物酶引物酶(primase) 復制起始時催化生成復制起始時催化生成RNA 引物的酶。引物的酶。 單鏈單鏈DNA結合蛋白結合蛋白(single stranded DNA binding protein, SSB) 在復制中維持模板處于單鏈狀在復制中維持模板處于單鏈狀 態(tài)并保護單鏈的完

24、整態(tài)并保護單鏈的完整。 目錄目錄 10 8 局部解鏈后局部解鏈后 （二）（二）DNA拓撲異構酶改變拓撲異構酶改變DNA超螺旋狀態(tài)超螺旋狀態(tài) n復制過程正超螺旋的形成：復制過程正超螺旋的形成： 目錄目錄 解鏈過程中正超螺旋的形成解鏈過程中正超螺旋的形成 目錄目錄 既能水解既能水解 、又能連接磷酸二酯鍵。、又能連接磷酸二酯鍵。 拓撲異構酶拓撲異構酶 拓撲異構酶拓撲異構酶 n拓撲異構酶分類：拓撲異構酶分類： n拓撲異構酶作用特點：拓撲異構酶作用特點： 目錄目錄 拓撲異拓撲異 構酶構酶 切斷切斷DNA雙鏈中雙鏈中一股一股鏈，使鏈，使DNA 解鏈旋轉不致打結；適當時候封解鏈旋轉不致打結；適當時候封 閉切

25、口，閉切口，DNA變?yōu)樗沙跔顟B(tài)變?yōu)樗沙跔顟B(tài)。 反應反應不需不需ATP。 拓撲異拓撲異 構酶構酶 切斷切斷DNA分子分子兩股兩股鏈，斷端通過鏈，斷端通過 切口旋轉使超螺旋松弛。切口旋轉使超螺旋松弛。 利用利用ATP供能，連接斷端，供能，連接斷端， DNA 分子進入負超螺旋狀態(tài)。分子進入負超螺旋狀態(tài)。 n作用機制：作用機制： 目錄目錄 n拓撲酶的作用方式：拓撲酶的作用方式： 目錄目錄 四、四、DNA連接酶連接復制中產(chǎn)生的連接酶連接復制中產(chǎn)生的 單鏈缺口單鏈缺口 連接連接DNA鏈鏈3 -OH末端和相鄰末端和相鄰DNA鏈鏈5 -P 末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從而把兩段相末端，使二者生成磷酸二酯鍵，從

26、而把兩段相 鄰的鄰的DNA鏈連接成一條完整的鏈。鏈連接成一條完整的鏈。 n DNA連接酶連接酶(DNA ligase)作用方式：作用方式： P O O- O- O HO5 P O O- O- O 3 3 5 DNA連接酶連接酶 ATP ADP 53 53 nDNA連接酶的作用：連接酶的作用： 目錄目錄 DNA連接酶在復制中起最后接合缺口的連接酶在復制中起最后接合缺口的 作用。作用。 在在DNA修復、重組及剪接中也起縫合缺修復、重組及剪接中也起縫合缺 口作用?？谧饔谩?也是基因工程的重要工具酶之一。也是基因工程的重要工具酶之一。 n功能：功能： 目錄目錄 提供核糖提供核糖3 -OH提供提供5 -

27、P結果結果 DNA聚合酶聚合酶引物或延長中的引物或延長中的 新鏈新鏈 游離游離dNTP 去去PPi (dNTP)n+1 連接酶連接酶復制中不連續(xù)的兩條單鏈復制中不連續(xù)的兩條單鏈不連續(xù)不連續(xù)連續(xù)鏈連續(xù)鏈 拓撲酶拓撲酶切斷、整理后的兩鏈切斷、整理后的兩鏈改變拓撲狀態(tài)改變拓撲狀態(tài) DNA聚合酶，拓撲酶和連接酶催化聚合酶，拓撲酶和連接酶催化 3 ,5 -磷酸二酯鍵生成的比較磷酸二酯鍵生成的比較 目錄目錄 原核生物原核生物DNA復制過程復制過程 The Process of DNA Replication in Prokaryotes 第第 三三 節(jié)節(jié) 目錄目錄 起始是復制中較為復雜的環(huán)節(jié)，在此過程起始

28、是復制中較為復雜的環(huán)節(jié)，在此過程 中，各種酶和蛋白因子在復制起始點處裝配引中，各種酶和蛋白因子在復制起始點處裝配引 發(fā)體，形成復制叉并合成發(fā)體，形成復制叉并合成RNARNA引物。引物。 需要解決兩個問題：需要解決兩個問題： 1. DNA解開成單鏈，提供模板。解開成單鏈，提供模板。 2. 形成引發(fā)體，合成引物，提供形成引發(fā)體，合成引物，提供3 -OH末端。末端。 一、一、復制的起始復制的起始 目錄目錄 E.coli復制起始點復制起始點 oriC GATTNTTTATTT GATCTNTTNTATT GATCTCTTATTAG 1 13 17 29 32 44 1 13 17 29 32 44 T

29、GTGGATTA-TTATACACA-TTTGGATAA-TTATCCACA 58 66 166 174 201 209 237 24558 66 166 174 201 209 237 245 串聯(lián)重復序列串聯(lián)重復序列 反向重復序列反向重復序列 5 3 5 3 （一）（一） DNA的解鏈的解鏈 目錄目錄 原核生物的復制起始部位及解鏈原核生物的復制起始部位及解鏈 目錄目錄 目錄目錄 Dna A Dna B、 Dna C DNA拓撲異構酶拓撲異構酶 引物引物 酶酶 SSB 3 5 3 5 （二）引物合成和引發(fā)體形成（二）引物合成和引發(fā)體形成 含有解螺旋酶、含有解螺旋酶、DnaC蛋白、引物酶和蛋白

30、、引物酶和DNA 復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。復制起始區(qū)域的復合結構稱為引發(fā)體。 目錄目錄 3 5 3 5 引物是由引物酶催化合成的短鏈引物是由引物酶催化合成的短鏈RNA分子。分子。 引物引物 3 HO 5 引物引物 酶酶 目錄目錄 引發(fā)體和復制叉的生成引發(fā)體和復制叉的生成 目錄目錄 目錄目錄 二、二、DNA鏈的延長鏈的延長 復制的延長指在復制的延長指在DNA-pol催化下，催化下，dNTP以以 dNMP的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上，的方式逐個加入引物或延長中的子鏈上， 其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。其化學本質是磷酸二酯鍵的不斷生成。 5 5 3 3 5 5 dATP dGTP

31、 dTTP dCTP dTTP dGTPdATP dCTP OH 3 3 3 DNA-pol 目錄目錄 n領頭鏈的合成：領頭鏈的合成： 領頭鏈的子鏈沿著領頭鏈的子鏈沿著5 5 33 方向可以連續(xù)地延長。方向可以連續(xù)地延長。 n后隨鏈的合成后隨鏈的合成 目錄目錄 在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈在復制叉同時合成前導鏈和后隨鏈 復復 制制 過過 程程 簡簡 圖圖 目錄目錄 目錄目錄 原核生物基因是環(huán)狀原核生物基因是環(huán)狀DNA，雙向復制的復制片段，雙向復制的復制片段 在復制的終止點在復制的終止點(ter)處匯合。處匯合。 ori ter E.coli 82 32 ori ter SV40 50 0 三

32、、復制的終止三、復制的終止 目錄目錄 5 5 5 RNA酶酶 OHP 5 DNA-pol dNTP 5 5 P ATP ADP+Pi 5 5 DNA連接酶連接酶 n 子鏈中的子鏈中的RNA引物被取代引物被取代 目錄目錄 目錄目錄 目錄目錄 真核生物真核生物DNA生物合成生物合成過程過程 The Process of DNA Biosynthesis in eukaryotes 第第 四四 節(jié)節(jié) 目錄目錄 真核生物復制子多、岡崎片段短、復制叉真核生物復制子多、岡崎片段短、復制叉 前進速度慢等；前進速度慢等； DNA復制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生復制從引發(fā)進入延伸階段發(fā)生DNA聚聚 合酶合酶 / 轉換

33、；轉換； 切除岡崎片段切除岡崎片段RNA引物的是核酸酶引物的是核酸酶RNAse H和和FEN1等。等。 真核生物與原核生物真核生物與原核生物DNA復制的差異：復制的差異： 目錄目錄 哺乳動物的哺乳動物的 細胞周期細胞周期 DNA合成期合成期 G1 G2 S M 細胞能否分裂，決定于進入細胞能否分裂，決定于進入S期及期及M期這兩個關期這兩個關 鍵點。鍵點。G1S及及G2M的調節(jié)，與蛋白激酶活的調節(jié)，與蛋白激酶活 性有關。性有關。 蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子蛋白激酶通過磷酸化激活或抑制各種復制因子 而實施調控作用。而實施調控作用。 目錄目錄 真核生物每個染色體有多個起始點，是多復制真

34、核生物每個染色體有多個起始點，是多復制 子復制。子復制。復制有時序性，即復制子以分組方式復制有時序性，即復制子以分組方式 激活而不是同步起動。激活而不是同步起動。 復制的起始需要復制的起始需要DNA-pol （引物酶活性）和（引物酶活性）和 pol （解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復（解螺旋酶活性）參與。還需拓撲酶和復 制因子制因子(replication factor, RF)。 一、真核生物復制的起始與原核基本相似一、真核生物復制的起始與原核基本相似 目錄目錄 酵母復制起點為酵母復制起點為自主復制序列（自主復制序列（autonomously replicating sequences，A

35、RS）： 酵母染色體含有多個復制起點。酵母染色體含有多個復制起點。 元件元件A(富含富含A/T的共有序列的共有序列)：結合一個特異的蛋白質：結合一個特異的蛋白質 復合物復合物復制起點識別復合物復制起點識別復合物(ORC)。 3個序列個序列(B1、B2和和B3)可以增加復制起點的效率，其可以增加復制起點的效率，其 中中B2的的9個堿基與上述個堿基與上述ARS共有序列相同。共有序列相同。 酵母復制起始點酵母復制起始點 目錄目錄 增殖細胞核抗原（增殖細胞核抗原（proliferation cell nuclear antigen，PCNA）在復制起始和延長中起關鍵作在復制起始和延長中起關鍵作 用。用

36、。PCNA為同源三聚體，具有與為同源三聚體，具有與E.coli DNA 聚聚 合酶合酶的的亞基相同的功能和相似的構象，即形亞基相同的功能和相似的構象，即形 成閉合環(huán)形的可滑動成閉合環(huán)形的可滑動DNA夾子，在夾子，在RFC的作用下的作用下 PCNA結合于引物模板鏈；并且結合于引物模板鏈；并且PCNA使使pol 獲得持續(xù)合成能力。獲得持續(xù)合成能力。PCNA水平也是檢驗細胞增水平也是檢驗細胞增 殖的重要指標。殖的重要指標。 目錄目錄 拓撲異構酶，去除負超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復制叉前方產(chǎn)生的正拓撲異構酶，去除負超螺旋（使解旋酶容易解旋），去除復制叉前方產(chǎn)生的正 超螺旋超螺旋 Tol和和Tol

37、 DNA雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體雙螺旋解鏈，參與組裝引發(fā)體DNA解旋酶解旋酶 連接岡崎片段連接岡崎片段DNA連接酶連接酶 核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物RNAse H 核酸酶，切除核酸酶，切除RNA引物引物FEN1 DNA復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復復制，核苷酸切除修復，堿基切除修復Pol / 合成合成RNA-DNA引物引物Pol /引發(fā)酶引發(fā)酶 有依賴有依賴DNA的的ATPase活性，結合于引物活性，結合于引物-模板鏈，激活模板鏈，激活DNA聚合酶，聚合酶， 促使促使PCNA結合于引物結合于引物-模板鏈模板鏈 RFC 激活激活DNA聚合酶和聚合酶和RFC的的ATPase活性活

38、性PCNA 單鏈單鏈DNA結合蛋白，激活結合蛋白，激活DNA聚合酶，使解旋酶容易結合聚合酶，使解旋酶容易結合DNARPA 功功 能能蛋白質蛋白質 真核真核DNA復制叉主要蛋白質的功能復制叉主要蛋白質的功能 目錄目錄 DNA-pol 和和pol 分別兼有解螺旋酶和引物酶活分別兼有解螺旋酶和引物酶活 性。在復制叉及引物生成后，性。在復制叉及引物生成后，DNA-pol 通過通過 PCNA的協(xié)同作用，逐步取代的協(xié)同作用，逐步取代pol ，在，在RNA引物引物 的的3 -OH基礎上連續(xù)合成領頭鏈。隨從鏈引物也基礎上連續(xù)合成領頭鏈。隨從鏈引物也 由由pol 催化合成。然后由催化合成。然后由PCNA協(xié)同，協(xié)

39、同，pol 置換置換 pol ，繼續(xù)合成，繼續(xù)合成DNA子鏈。子鏈。 二、真核生物復制的延長發(fā)生二、真核生物復制的延長發(fā)生DNA 聚合酶聚合酶/轉換轉換 目錄目錄 前導鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期前導鏈：出現(xiàn)在引發(fā)后期 后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際后隨鏈：發(fā)生于每個岡崎片段合成之際 發(fā)生發(fā)生DNA聚合酶聚合酶 / 轉換的原因是轉換的原因是Pol 不具備不具備 持續(xù)合成能力持續(xù)合成能力。 DNA聚合酶聚合酶 / 轉換的轉換的關鍵蛋白是關鍵蛋白是RFC。 DNA聚合酶聚合酶 / 轉換轉換 目錄目錄 真核真核DNA聚聚 合酶轉換和合酶轉換和 后隨鏈合成后隨鏈合成 目錄目錄 3 5 5 3 領頭鏈領頭鏈

40、3 5 3 5 親代親代DNA 后隨鏈后隨鏈 引物引物 核小體核小體 三、真核生物三、真核生物DNA合成后立即組裝成核小體合成后立即組裝成核小體 目錄目錄 染色體染色體DNA呈線狀，復制在末端停止。呈線狀，復制在末端停止。 復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。復制中岡崎片段的連接，復制子之間的連接。 染色體兩端染色體兩端DNA子鏈上最后復制的子鏈上最后復制的RNA引物，引物， 去除后留下空隙。去除后留下空隙。 四、端粒酶參與解決染色體末端復制問題四、端粒酶參與解決染色體末端復制問題 目錄目錄 n切除引物的兩種機制切除引物的兩種機制 目錄目錄 前導鏈前導鏈產(chǎn)生產(chǎn)生完整完整 的子染色單體。的子

41、染色單體。 后隨鏈后隨鏈3 3 端留下端留下 縮短的縮短的未復制的未復制的 ssDNA區(qū)區(qū)。 5 3 3 5 5 3 3 5 + 5 3 3 3 3 5 5 目錄目錄 端粒（端粒（telomeres）由富含由富含TG的重復序列組成。的重復序列組成。 人的端粒重復序列為人的端粒重復序列為5-(TnGn)x-3 。 這些重復序列多為雙鏈，但每個染色體的這些重復序列多為雙鏈，但每個染色體的3端比端比 5 端長，形成單鏈端長，形成單鏈ssDNA。這一特殊結構可解決。這一特殊結構可解決 染色體末端復制問題。染色體末端復制問題。 目錄目錄 端粒酶端粒酶(telomerase) 端粒酶端粒酶RNA (hum

42、an telomerase RNA, hTR) 端粒酶協(xié)同蛋白端粒酶協(xié)同蛋白(human telomerase associated protein 1, hTP1) 端粒酶逆轉錄酶端粒酶逆轉錄酶(human telomerase reverse transcriptase, hTRT) n組成：組成： 目錄目錄 端粒酶（端粒酶（telomerase）是一種核糖核蛋白（是一種核糖核蛋白（RNP），）， 由由RNA和蛋白質組成。和蛋白質組成。 端粒酶以自己的端粒酶以自己的RNA組分作為模板，以染色體的組分作為模板，以染色體的3 端端ssDNA（后隨鏈模板）（后隨鏈模板）為引物，將端粒序列添加為引

43、物，將端粒序列添加 于染色體的于染色體的3 端。這些新合成的端。這些新合成的DNA為單鏈為單鏈。 目錄目錄 n端粒酶催化作用的爬行模型端粒酶催化作用的爬行模型 目錄目錄 真核所有染色體真核所有染色體DNA復制僅僅出現(xiàn)在細胞復制僅僅出現(xiàn)在細胞 周期的周期的S期期，而且只能復制一次。，而且只能復制一次。 五、真核生物染色體五、真核生物染色體DNA在每個細胞周在每個細胞周 期中只能復制一次期中只能復制一次 目錄目錄 前復制復合物在前復制復合物在G1期形成而在期形成而在S期被激活期被激活 真核細胞真核細胞DNA復制的起始分兩步進行，即復制的起始分兩步進行，即復復 制基因的選擇制基因的選擇和和復制起點的

44、激活。復制起點的激活。 復制基因（復制基因（replicator）是指是指DNA復制起始復制起始所所 必需的必需的全部全部DNA序列序列。 目錄目錄 復制基因的選擇復制基因的選擇出現(xiàn)于出現(xiàn)于G1期期，基因組的每個復，基因組的每個復 制基因位點均組裝制基因位點均組裝前復制復合物（前復制復合物（pre- replicative complex，pre-RC）。 復制起點的激活復制起點的激活出現(xiàn)于細胞進入出現(xiàn)于細胞進入S期期以后，這一以后，這一 階段將階段將激活激活pre-RC，募集若干復制基因結合蛋，募集若干復制基因結合蛋 白和白和DNA聚合酶，并起始聚合酶，并起始DNA解旋。解旋。 在原核細胞中

45、，復制基因的識別與在原核細胞中，復制基因的識別與DNA解解 旋、募集旋、募集DNA聚合酶偶聯(lián)進行。而在真核細胞聚合酶偶聯(lián)進行。而在真核細胞 中，這兩個階段相分離可以確保每個染色體在中，這兩個階段相分離可以確保每個染色體在 每個細胞周期中僅復制一次。每個細胞周期中僅復制一次。 目錄目錄 ORC至少募集兩種解旋酶加載至少募集兩種解旋酶加載 蛋白蛋白Cdc6和和Cdt1。 復制起點識別復合物（復制起點識別復合物（origin recognition complex，ORC） 識別并結合復制基因。識別并結合復制基因。 三種蛋白質一起募集真核細胞三種蛋白質一起募集真核細胞 解旋酶解旋酶Mcm2-7。 前

46、復制復合物（前復制復合物（pre-RC）的形成）的形成 目錄目錄 pre-RC磷酸化導致在復制起點組裝其它復制因子磷酸化導致在復制起點組裝其它復制因子 并起始復制，復制因子包括并起始復制，復制因子包括3種種DNA聚合酶。聚合酶。 DNA聚合酶在復制起點按一定順序組裝：首先聚合酶在復制起點按一定順序組裝：首先 Pol 和和Pol 結合，然后是結合，然后是Pol /引發(fā)酶。引發(fā)酶。 在在S期期，pre-RC被蛋白激酶（被蛋白激酶（Ddk和和Cdk）磷）磷 酸化，從而被激活。酸化，從而被激活。 目錄目錄 pre-RC的激活的激活 和組裝真核和組裝真核 DNA復制叉復制叉 目錄目錄 （1）激活）激活p

47、re-RC，以起始，以起始DNA復制；復制； （2）抑制形成新的）抑制形成新的pre-RC。 CDK控制控制pre-RC的形成和激活的形成和激活 真核細胞通過依賴細胞周期蛋白的蛋白激真核細胞通過依賴細胞周期蛋白的蛋白激 酶（酶（cyclin-dependent kinases，CDK）嚴格控制）嚴格控制 pre-RC的形成和激活。的形成和激活。 Cdk功能：功能： 目錄目錄 在每個細胞周期過程中，僅有一次機會形成在每個細胞周期過程中，僅有一次機會形成 pre-RC，也僅有一次機會激活，也僅有一次機會激活pre-RC。 pre-RC在被激活后即解體，所暴露的復制基在被激活后即解體，所暴露的復制基 因可形成新的因可形成新的pre-RC并迅速結合并迅速結合ORC。但在。但在S、 G2和和M期，高活性的期，高活性的Cdk抑制抑制pre-RC的其它組分的其它組分 結合結合ORC。只有當染色體分離和細胞分裂完成時，。只有當染色體分離和細胞分裂完成時， Cdk的活性消失，新的的活性消失，新的pre-RC才能形成。才能形成。 目錄目錄 逆轉錄和其他復制方式逆轉錄和其他復制方式 Reverse Transcription & Other DNA Replication Ways 第五節(jié)第五節(jié) 目錄目錄 雙鏈雙鏈DNA是大多數(shù)生物的遺傳物質。某些是大多數(shù)生物的遺傳物質。某些