1、基因工程抗體 和 新型抗體 第一節 小分子抗體 第二節 雙價及雙特異抗體分子 第三節 抗體免疫偶聯物 第四節 抗體融合蛋白 第一節 小分子抗體 抗體分子的抗原結合部位局限在可變區 組成的Fv段，從而可以構建分子量較小 的具有抗原結合功能的分子片段，稱為 小分子抗體。 優點 可以在原核細胞表達，降低生產成本； 分子量小，易于穿過血管壁或組織屏障，進入病 灶部位，有利于對腫瘤等疾病的治療； 不含Fc段，可減少因廣泛分布的Fc受體而帶來的 不利影響，如放射免疫顯像時的本底； 在體內半衰期短，雖在靶向治療時不利，但有利 于體內毒性物質的清除和降低放射免疫顯像的本 底； 易于進一步進行基因工程改造，如構

2、建抗體融合 蛋白等。 一、Fab 由重鏈Fd段和完整的輕鏈組成，兩 者通過一個鏈間二硫鍵連接，形成 異二聚體，是完整抗體分子的三分 之一，僅有一個抗原結合位點。 早期Fab段的制備通過木瓜蛋白酶對 完整抗體分子酶解后分離純化獲得， 現已能從大腸桿菌表達獲得。 Papain Fc Fab Fab段由于有二硫鍵連接輕鏈和Fd段，分 子結構比較穩定，且較好地保持了天然 抗體分子的Fv段的結構。 但其在原核細胞的表達因雙鏈結構而較 為困難，分泌型表達受到蛋白分子穿過 內膜和折疊效率低下的影響表達量較低。 主要用作實驗室研究工具主要用作實驗室研究工具，如作為 抗體分子片段構建噬菌體抗體，鑒定抗 體可變區

3、基因的功能活性等。 二、Fv 是抗體分子中保留抗原結合部位的最小功最小功 能片段能片段，由輕鏈可變區和重鏈可變區組成， 兩者以非共價鍵結合在一起。 通過將Vh和Vl轉送到大腸桿菌周質腔，可獲 得有功能的Fv段。但極不穩定，使用很少極不穩定，使用很少。 三、ScFv 是由一條鏈接肽（linker)將VH和VL連在一起所 形成的兩個可變區首尾相接的單一肽鏈，通過 正確折疊，兩個可變區由非共價鍵形成具有抗 原結合功能的Fv段。 此單一肽鏈的結構既有利于在大腸桿菌的表達 和進行基因重組操作，也增加了Fv的穩定性。 由于其易于構建和表達，是目前報道最多的目前報道最多的 基因工程抗體基因工程抗體。 構建

4、VH-linker-VL或或VL-linker-VH, 兩種方式構 建的ScFv的特異性和親和力相同。 Linker對保持親本抗體的親和力有重要影 響，應不影響Fv的立體結構，其長度應 不短于3.5nm，也不宜過長，大多為大多為14- 15個氨基酸殘基個氨基酸殘基。 應用最廣泛的是（應用最廣泛的是（GGGGS)3，G分子量最小，側鏈最短， 可增加側鏈的柔性，S是親水性最強的氨基酸，可增加 linker的親水性。 缺點缺點 有時ScFv比其親本抗體的親和力明顯降親和力明顯降 低低，并常常顯示聚集傾向聚集傾向，尤其在37度 時穩定性較差穩定性較差，這與輕重鏈可變區由作 用力較弱的非共價鍵連接在一起

5、有關。 四、dsFv 在VH和和VL之間導入了一個鏈間二硫鍵之間導入了一個鏈間二硫鍵，構 建了disulfide-stabilized Fv, dsFv。 二硫鍵可設計在CDR也可在骨架區。由于 CDR涉及抗原結合，需了解Fv段的立體結構 才能確定正確的引入二硫鍵的部位。在遠 離CDR的結構較保守的骨架區設計二硫鍵， 具備通用性。 迄今已有十余個dsFv見諸報道，與相應scFv 相比，其穩定性有非常明顯的改進穩定性有非常明顯的改進。 對于抗體的抗原結合活性，dsFv與scFv相比 則有不同情況，有的結合能力不變，有的 增強，有的下降。 應用前景 靶向載體：抗體分子能與抗原特異性結合 的特性可用

6、于臨床某些疾病，尤其是腫瘤 的顯像定位診斷和靶向治療。 構建其它工程抗體：scFv可進一步改建為雙 鏈抗體、三鏈抗體及diabody等多價小分子 抗體，也可與其它基因融合構建免疫毒素 等抗體融合蛋白，用于臨床靶向治療。 細胞內抗體（intrabody) 將小分子抗體基因導入細胞內，使其在細胞內特 定部位表達，通過與靶抗原的結合影響其生物學通過與靶抗原的結合影響其生物學 活性活性，即為細胞內抗體。 通過對小分子抗體基因的修飾可將其表達到細胞通過對小分子抗體基因的修飾可將其表達到細胞 的不同部位的不同部位，如將前導肽中的疏水區換成親水氨 基酸殘基或將前導肽去除，失去分泌能力的抗體 分子可表達在細胞

7、漿內；將前導肽的疏水區換成 核定位前導序列，可表達在細胞核內。 細胞內抗體的應用細胞內抗體的應用 表型敲除表型敲除：在細胞內表達特定抗體分子阻斷某 內源蛋白的活性，可用研究靶蛋白的生物學功 能。 基因治療基因治療：通過細胞內抗體對某些蛋白功能的 干擾也可達到基因治療的目的，如利用癌基因 的細胞內抗體為抗腫瘤的基因治療提供了一個 新的途徑。 目前抗HIV gp120（外殼蛋白）的Fab段和抗Tat （調節蛋白）的scFv已進入臨床試用。 五、單域抗體 有些抗體的重鏈可變區單獨也可以結合抗原，從而提 出分子量更小的單域抗體（single domain antibody): VH。 又稱納米抗體（n

8、anobody）或重鏈抗體（heavy chain antibody，hcAb）。 是從駱駝科動物和鯊魚的血清中分離出的一種抗體， 其體積約為傳統抗體的1/10。 優點優點：分子量進一步減小，有利于小分子抗體的應用； 操作簡便；較Fv和scFv更為穩定；其抗原結合部位的構 象較為特殊，可造成特殊的抗體抗原結合形式，CDR可 插入抗原表面的凹陷中。在免疫實驗、診斷與治療中，在免疫實驗、診斷與治療中， 它將發揮超乎想象的巨大功能它將發揮超乎想象的巨大功能。 第二節 雙（多）價及雙特異抗體分子 所有天然抗體分子至少是雙價的，而生物性抗原抗原也 往往是多價多價的，如病毒表面有重復性蛋白結構重復性蛋白結

9、構，細 胞表面有多副本的膜蛋白。 多個抗原結合部位同時與同一表面上重復存在的抗 原決定簇結合可以得到更高的功能性親和力更高的功能性親和力 （avidity)。 多價結合多價結合還可以引起進一步的效應效應：如有些多價抗 體與細胞表面分子結合時，可引起與單價抗體完全 不同的效果，導致受體交聯，激發細胞內的信號傳導致受體交聯，激發細胞內的信號傳 導，誘發細胞的激活或凋亡導，誘發細胞的激活或凋亡等生物學效應。 將小分子抗體改建為雙價或多價成為抗體工程 中活躍的領域之一。 一、雙價及多價抗體分子 （一）體外交聯體外交聯構建雙價抗體 在小分子抗體的羧基端設計半胱氨酸殘基，在 體外通過化學交聯成為雙價抗體分

10、子。（應 用不多） （二）通過自聚化結構域自聚化結構域建雙（多）價抗體 將具有自聚化傾向的結構域（dimerization domain 或association domian)連接在單價小分 子抗體的3端，可促使抗體分子片段多聚化。 （三）雙鏈抗體（diabody)及三鏈抗體 （triabody) 通過縮短縮短scFv的接頭的接頭，使兩個單鏈抗體分子間互 相形成VH和VL配對，以非共價鍵結合在一起形成二 聚體，從而構建出的雙價小分子抗體。 如果將兩個不同特異性的單鏈抗體分子的VH和VL 交叉組合構建兩個雜合的單鏈抗體兩個雜合的單鏈抗體基因，重組到同 一表達載體中，則可在大腸桿菌中表達出雙特異

11、雙 鏈抗體。 縮短scFv的接頭不僅可形成雙鏈分子，還 可產生三鏈抗體（triabody,三價）以及四 鏈抗體（tetrabody,四價）分子。 雙鏈抗體和minibody迄今顯示了最好的腫 瘤靶向、瘤組織穿透力和血清清除率的平衡， 可能成為免疫治療最具潛力的載體。 二、雙特異抗體雙特異抗體 通過人為的操作使一個抗體分子一個抗體分子具有兩種不同的兩種不同的 特異性特異性，其中一個特異性指向體內的效應系統， 另一個特異性結合靶抗原，將激活的生物效應橋 連于治療靶標，達到治療目的。 這種特殊的作用機制使雙特異抗體成為引人注目 的免疫治療藥物免疫治療藥物，目前其應用的主要目標是腫瘤主要目標是腫瘤，

12、其次在感染性疾病也展示了誘人的前景。 28 雙特異抗體在腫瘤診斷和治療中的應用 介導細胞免疫的細胞毒性效應介導細胞免疫的細胞毒性效應 通過BsAb介導細胞毒作用殺死腫瘤細胞殺死腫瘤細胞是當 前免疫治療應用研究的熱點，其主要模式是 BsAb同時結合效應細胞和腫瘤細胞的表面抗原， 直接觸發效應細胞對腫瘤細胞的特異性殺傷。 31 雙特異性抗體的效應靶 效應細胞效應細胞靶分子靶分子 效應效應 T細胞 TCR/CD3,CD2殺傷腫瘤細胞 NK細胞 FcRIII,CD44,CD56,CD38 殺傷腫瘤細胞 病毒感染細胞 中性粒細胞FcRI,CR3, Fc RI 殺傷腫瘤細胞 病毒感染細胞 單核巨噬細胞Fc

13、RI,CR3, FcRI 殺傷腫瘤細胞 病毒感染細胞 樹突狀細胞FcR抗原遞呈 紅細胞CR1免疫粘附 雙特異抗體的研究已經發展到了一個重要的階 段,從抗體的穩定性產量和純度來說,有些已基 本上滿足了臨床上的要求. 抗CD3/抗腫瘤雙特異抗體在臨床上具有較好的 應用前景,特別是在控制腫瘤的微小轉移灶方面 有著重大的臨床應用價值,表現為既可能根治腫 瘤,又可以激發機體自身產生和維持較長時間的 免疫保護作用. 有資料表明,在美國和歐洲等地,目前至少有 10個臨床中心在進行這種抗CD3/抗腫瘤( 包括乳腺癌卵巢癌淋巴瘤腎細胞癌和神經 膠質瘤等)雙特異抗體臨床試驗,不但安全性 得到證實,而且在一些腫瘤患

14、者,尤其是晚期 腫瘤患者中已觀察到初步療效,特別是治療 B細胞惡性腫瘤患者時,療效明顯. 安進于2012年耗資12億美元收購Micromet公司，獲得了一種 創新的癌癥免疫療法BiTE抗體技。 今年9月，安進向FDA提交首個BiTE療法blinatumomab上市 申請。 FDA日前表示，已接受審查BiTE免疫療法blinatumomab生物 制品許可申請（BLA），同時已授予該藥優先審查資格。 此前，FDA和EMA均已授予該藥孤兒藥地位，FDA還授予該 藥突破性療法認定。 blinatumomab（AMG103）是一種實驗性雙特異性T細胞銜接器 （BiTE），該藥是一種雙特異性單鏈抗體，靶向

15、CD19和CD3分子。 BiTE抗體，旨在引導人體自身的T細胞殺手攻擊腫瘤細胞，并能夠 在低濃度下起作用。BiTE抗體技術代表了一種創新的免疫治療方法。 blinatumomabBLA的提交，是基于一項II期臨床試驗的積極數據， 該項研究在費城染色體陰性（Ph-）復發性/難治性前體B細胞急性淋 巴細胞白血病（ALL）成人患者中開展，數據表明，經2輪 blinatumomab治療后，43%的患者實現完全緩解或伴有部分血液學 復蘇的完全緩解，達到了主要療效終點。 目前，關于成人復發性或難治性ALL，還沒有廣泛接受的標準治療 方案。blinatumomab有望顯著推進該類患者群體的臨床治療選擇， 而

16、BLA的提交，標志著實現這一目標的重要里程碑。 Expert Opin Biol Ther. 2015;15(8):1093-9. doi: 10.1517/14712598. Utilizing the BiTE (bispecific T-cell engager) platform for immunotherapy of cancer. Figure 2. Engagement by BiTE antibody constructs leads to activation and polyclonal expansion of T-cells. The activation of T-

17、cells requires the presence of target cells. Upon binding of the BiTE antibody construct to both CD3 on T-cells and the tumor-associated antigen on target cells, the formation of an immunological synapse is forced, thereby bypassing MHC/antigen-dependent activation of T-cells. Activation is achieved

18、 independently of TCR specificity, costimulation, or peptide antigen presentation. Subsequent to formation of the immunological synapse, apoptosis of the target cell is induced 8,9,27,28. 腫瘤導向治療的常規方法是將MAb與化療藥物、毒素或放射 性核素耦聯，但往往導致抗體或藥物活性喪失。 BsAb以抗原抗體反應代替了化學耦聯，從而可較好地介導 藥物或毒素對腫瘤的殺傷效應。 首先使針對腫瘤抗原的BsAb定位于靶部

19、位，待循環中的 BsAb廓清后再注入藥物，能過抗原抗體反應使其聚集于腫瘤 部位。 介導藥物的導向治療介導藥物的導向治療 大量實驗證明BsAb介導 的藥物或毒素對腫瘤 的殺傷效應明顯優于 MAb導向藥物。 在腫瘤放射免疫顯像中的應用在腫瘤放射免疫顯像中的應用 放射顯像在臨床中應用極為廣泛，也為臨床診療提 供了病變定位的指導依據，但同時放射性標記對正常組織 也存在傷害。 BsAb的一條臂針對腫瘤細胞表面抗體，另一條 臂針對能與放射性核素結合的半抗原螯合劑，則可 用于腫瘤放射免疫顯像。 研究表明應用雙特異性抗體能夠有效提高放射 性標記物對病變部位的趨向性，減少對正常組織的 損害。 在免疫相關性疾病治

20、療中的應用在免疫相關性疾病治療中的應用 Tam等研究了IGE/Fc雙特異性抗體對人肥大細胞和嗜 堿性粒細胞的作用，提示IGE/Fc雙特異性抗體不僅未 引發IgE致敏的細胞中組胺的釋放，而且阻止了引起組胺 釋放的特定抗原的觸發，證明IGE/Fc雙特異性抗體能 夠應用在過敏性疾病的治療，同時抑制肥大細胞和嗜堿性 粒細胞的活化抑制; 目前,雙特異性抗體研究最主要的任務是 需要通過更多的臨床實驗證明它們的有 效性,并在此過程中為雙特異抗體臨床應 用制定一些療效標準,以便為以后該型抗 體在臨床上廣泛應用奠定基礎。 有應用價值的有應用價值的BsAb至少應具有以下特性：至少應具有以下特性： 高選擇性及高親和

21、性地結合腫瘤相關抗原； 在循環系統中，BsAb與效應細胞或細胞毒性觸發 分子應有較低的親和力，以限制全身性效應細胞 活化引起的不良反應，但當BsAb結合于表達靶抗 原的腫瘤細胞時又必須能有效地誘導效應細胞的 細胞毒性； BsAb應為人源化的抗體； 分子大小適中，既能滲透到腫瘤組織內部，又能 保證適當的循環滯留時間。 45 雙特異性抗體的應用 免疫診斷免疫診斷 腫瘤放射顯影腫瘤放射顯影 腫瘤藥物殺傷腫瘤藥物殺傷 腫瘤的免疫殺傷腫瘤的免疫殺傷 乳腺癌、淋巴母細胞白血病、神經膠質瘤乳腺癌、淋巴母細胞白血病、神經膠質瘤 46 構建策略 雙特異性抗體的構建方法雙特異性抗體的構建方法 u雜化雜交瘤技術雜化

22、雜交瘤技術 將具有某種特異性（如抗瘤細胞）的McAb細 胞株與具有抗第二抗原（如蓖麻毒蛋白）的小 鼠脾細胞進行融合，即產生出雜化雜交瘤細胞 株的二價瘤體。 47 雜化雜交瘤技術產生的雙特異性抗體 48 雜化雜交瘤分泌的抗體形式雜化雜交瘤分泌的抗體形式 保持原特異性抗體分子： L1H1-H1L1，L2H2-H2L2 重鏈特異性相同的配對抗體分子： L1H1-H1L2，L1H2-H2L1 L2H1-H1L2，L1H2-H2L2 重鏈、輕鏈特異性不同的配對抗體分子： L1H1-H2L2，L1H2-H1L2 L1H1-H2L1，L2H2-H1L2 49 只有L1H1-H2L2才是所需的雙特異性抗體 5

23、0 雜化雜交瘤方法的不足雜化雜交瘤方法的不足 產量低，僅占10% 產物需篩選，費時費力 瘤株不穩定 51 構建策略 雙特異性抗體的構建方法雙特異性抗體的構建方法 u化學交聯法化學交聯法 Nisonoff和Rivers最早開始研究 化學交聯無需經過細胞融合，比較簡便易行。 通常利用重鏈與輕鏈這間的二硫鏈經還原和再 氧化，將兩種不同特異性抗體的半分子結合在一 起。或用雙功能交聯劑，如鄰苯酸酯等，把兩個 抗體半分子交聯在一起。 52 化學交聯的雙特異性抗體 53 構建策略 雙特異性抗體的構建方法雙特異性抗體的構建方法 u化學交聯法化學交聯法 用于制備雙功能抗體的McAb可以是完整分子， 也可是經胃酶

24、水解獲得F（ab）2片段。后者 在減少鼠源免疫原性方面，效果較好。 54 構建策略 雙特異性抗體的構建方法雙特異性抗體的構建方法 u基因工程技術基因工程技術 利用分子生物學技術設計產生雙功能抗體 常見有四種構建形式，多為小分子抗體。 55 末端半胱氨酸殘基（末端半胱氨酸殘基（CysCys）共價交聯）共價交聯 在兩種scFv分子C末端分別帶上自由的Cys， 通過常規二硫鍵共價交聯，形成雙特異性抗體 VLAVHA LCys VLBVHB LCys -S-S- 56 單鏈雙特異性抗體單鏈雙特異性抗體 將兩種scFv分子基因用linker連接在一起， 然后表達形成雙特異性抗體 VLAVHA L VLBVHB L L 57 微型雙特異性抗體微型雙特異性抗體 利用專門二聚化結構將兩種scFv分子連接在 一起，形成雙特異性抗體 如利用fos和jun基因的亮氨酸拉鏈序列： VLAVHA Lfos VLBVHB Ljun 58 雙體型雙特異性抗體雙體型雙特異性抗體 將兩種不同抗體的VH和VL用較短的linker連 接形成兩種不同單鏈，當它們共表達時，其相 互間連接在一起，形成雙特異性抗體 1993，Ho