1、標題：免疫固定電泳版本號：a文件編號：pla301-ljk-zy-my-24發布日期：2003年3月1日生效日期：2003年3月15日發布部門：臨檢科質量管理小組編制人：馬駿龍、白潔、楊麗審核人：馬駿龍批準人(簽章)：秦小玲頁碼：第1頁，共6頁免疫固定電泳1 檢驗目的免疫固定電泳是通過分析單克隆ig的輕鏈和重鏈類型，幫助診斷多發性骨髓瘤、重鏈病、輕鏈病及半分子免疫球蛋白病的分型診斷，觀察疾病的變化及治療效果具有重要參考價值。2 檢測原理免疫固定電泳(immunofixation eletrophoresis，ife)將血清或其他標本在瓊脂(醋酸纖維素)平板上作區帶電泳，各種單一蛋白或復合蛋白成

2、分經電泳后按其電荷量、分子大小等所致電遷移率不同而分開。然后在其上加入已知相應單價抗血清(分別含有抗、輕鏈及各類重鏈抗血清)，當抗體與其區帶中的單克隆ig結合后，便形成抗原抗體復合物而沉淀(固定)下來。通過漂洗和染色，呈現濃而狹窄的著色區帶，即可判斷單克隆ig的輕鏈和重鏈類型。3 標本3.1 靜脈抽取病人空腹血標本2ml，置于含分離膠或含促凝劑的真空試管內。3.2 采血后應立即送到臨床檢驗科免疫檢驗室。3.3 樣品收到后不能及時測定的血清，應于28冰箱保存。4 設備和試劑4.1 hydrasys電泳分析儀(主機號：1423或1876)和hyrys-phoresis光密度掃描系統。4.2 瓊脂糖

3、凝膠：法國sebia公司的瓊脂糖凝膠(產品pn4150或4152)為應用型，凝膠內含8g/l瓊脂糖和tris巴比妥緩沖液(ph9.10.1)。4.3 tris-巴比妥緩沖液：每1份濃縮緩沖液瓶內加1升蒸餾水或去離子水，稀釋后tris-巴比妥溶液為應ph9.10.3。濃縮液可置于室溫或冰箱內保存，質量可穩定幾年或至少在試劑盒和緩沖液瓶上標簽注明的有效日期內。4.4 氨基黑染色液：每1份濃縮染液用蒸餾水或去離子水稀釋到300ml，稀釋后為工作液(4g/l氨基黑、10%乙酸)。濃縮和稀釋液可置于室溫或冰箱內保存，濃縮液質量可穩定在試劑盒瓶上標簽注明的有效日期內；已稀釋的緩沖液蓋緊瓶蓋在室溫內可穩定1

4、年。4.5 結晶紫染色液：1份濃縮結晶紫溶液內加蒸餾水或去離子水至300ml，稀釋后為工作染色液(2g/l結晶紫和10乙酸)。將濃縮或稀釋之染色液瓶蓋擰緊，避免蒸發并置于室溫或冰箱內保存。濃縮染液始終保持穩定，至少可穩定在試劑盒瓶上標簽注明的有效日期內，已稀釋之染液可穩定6個月。4.6 稀釋液、固定劑和抗血清：稀釋液為應用型(ph為7.50.3的堿性緩沖液、溴酚藍和防腐劑)；固定液為應用型(內含酸性溶液和防腐劑)，為便于區分，固定液具有特殊的顏色以避免混淆。抗血清均為應用型，所有抗血清內含哺乳動物相應抗人免疫球蛋白抗體，為便于分辨，抗血清的顏色與標簽所示顏色一致。在抗血清瓶的標簽或試劑盒上注明

5、的有效期內均可使用。4.7 脫色液：濃縮脫色液用蒸餾水或去離子水100倍稀釋后為脫色應用液(稀釋后脫色液內含檸檬酸5g/l)。脫色液用于凝膠染色后的脫色，以去除剩余的染料。稀釋脫色液須擰緊瓶蓋，置于室溫下可穩定1個月。5 操作步驟5.1 樣品準備選擇合適的瓊脂糖凝膠，每片2if可檢測2個標本，每片4if可測定4個標本。為了避免由抗原過剩引起的帶現象，樣本須先如表1稀釋后再進行點樣。當總免疫球蛋白水平20g/l時，稀釋劑量加倍(elp泳道除外)；當總免疫球蛋白的水平5g/l時，稀釋劑量減半(elp泳道除外)。表1 免疫固定電泳檢測血清樣品稀釋泳道氨基黑染色結晶紫染色血清稀釋劑血清稀釋劑蛋白電泳圖

6、譜(elp)30 l60 l30 l60 ligg免疫固定泳道20 l100 l20 l100 l其它免疫固定泳道30 l60 l30 l60 l某些單克隆免疫球蛋白可能因多聚體而導致所有的免疫固定泳道上均出現單克隆片段，在這種情況下，應先將血標本進行處理，用5l-巰基乙醇加于100l未稀釋的血清內，混勻并放置12分鐘后按規定程序繼續進行。5.2 操作方法法國sebia公司的hydrasys電泳系統是一種半自動的多元儀器，自動化步驟包括：電泳、用固定劑和抗血清孵育、烘干、染色、脫色和最后烘干。手工步驟包括：加樣和處理凝膠、加固定劑和抗血清以及啟動儀器。免疫固定是由五種混合多價抗血清進行反應，其

7、步驟為：應用固定劑和抗血清加于凝膠表面的泳道上，并讓固定劑和抗血清在凝膠內滲透擴散。使電泳后已分離的蛋白質被固定和產生免疫沉淀。使用吸水紙和清洗液將未沉淀的蛋白質去除，已被沉淀的蛋白質貯留在凝膠內。將凝膠染色，并進行觀察比較。5.2.1 電泳1.打開電源。2.將1個(用于2if)或2個(用于4if)點樣板置于平整表面，孔號位于加樣孔上方按序排列。每孔加10l已稀釋的樣品。每塊點樣板加樣應在2分鐘內完成。把點樣板放于濕盒內，齒梳向上放置。在最后一個樣品加樣完畢后讓樣品于齒梳中擴散5分鐘，如果不立即電泳(超過8小時)，則須將整個濕盒置于冰箱內。c.打開電泳艙蓋并升起電極和點樣支架。注意：在電極及點

8、樣支架升起時，不能直接關上電泳艙蓋。d.選擇“if”電泳程序(鍵盤左側)。e.取出含緩沖液的條帶，將條帶有塑料末端的那面緊貼電極掛置。f.取出凝膠放于平整界面。用一張薄濾紙輕輕地吸去凝膠表面多余的液體，然后快速移去濾紙。將200l蒸餾水加于電泳框面的下1/3處。彎曲凝膠，將其平鋪于電泳框面上，確定凝膠背面的氣泡被完全趕走。g.放下二個支架。這時，含緩沖液的條帶沒有接觸凝膠。不要強迫支架完全下降。h.從濕盒中取出點樣板。去除齒梳下的保護支架。2if的點樣板置于支架6號位，4if的2個點樣板則分別置于3號和9號。注意：點樣板上的數字必須面對操作者。i.關上電泳艙蓋。j.馬上按鍵盤左側(start)

9、鍵開始。注意：必須確保儀器右側的空氣通道不被堵塞。電泳的具體自動步驟：2個支架下降以便于含緩沖液的條帶及點樣板與凝膠表面接觸。樣品點樣板支架升起。電泳在20w的恒定功率下進行直到42vh為止。20恒溫由peltier系統控制。電極支架升起。聽到“嘟”聲后電泳艙蓋解鎖。屏幕顯示“reagent application”加試劑。5.2.2 免疫固定1.打開電泳艙蓋。2.取出點樣板并丟棄。3.移出2個支架，移去緩沖條帶并丟棄。4.放置加試劑的模板。5.按表2加抗血清試劑(避免混淆，試劑顏色與瓶上標簽及模板上的顏色相對應)。表2 免疫固定電泳抗血清試劑泳道體積(l)試劑顏色elp40固定液黃色igg2

10、5抗重鏈抗血清粉紅色iga25抗重鏈抗血清深蘭色igm25抗重鏈抗血清黃綠色kap25抗輕鏈抗血清淡綠色lam25抗輕鏈抗血清淡蘭色6.關上電泳艙蓋。7.按左側鍵盤的“start”鍵立即開始，屏幕顯示“incubation”孵育。免疫固定的具體步驟：20下孵育5分鐘。聽到“嘟”聲后電泳艙蓋解鎖。屏幕顯示“elim. reagent”。5.2.3 去除多余的試劑、清除剩余蛋白質1.打開電泳蓋。2.用濾紙吸去多余的試劑。3.按鍵盤左側“start”鍵開始。吸去試劑的具體步驟：試劑于20下在15秒內被吸去。聽到“嘟聲”，屏幕顯示“paper blotting”，用濾紙吸。5.2.4 清除剩余蛋白質1

11、.移去濾紙。2.抬起加試劑模板，并將其移開。3.將一張厚濾紙覆于凝膠上，使濾紙邊緣對齊一線，覆濾紙于凝膠表面，輕按濾紙表面以確定其完好地貼于凝膠表面。4.關上電泳艙蓋，按鍵盤左側的“start”鍵開始。5.用小刷子清洗模板，不可使用甲醇溶劑清洗。再次使用前確定模板完全干燥。用紙巾擦去孔內的水滴。去除剩余蛋白的具體步驟：溫控于40下吸去剩余蛋白質，約3分鐘。聽到“嘟”聲，屏幕顯示“paper+start”。5.2.6 烘干1.打開電泳艙蓋。2.移去濾紙。3.關上蓋子。4.按鍵盤左側的“start”鍵開始。烘干的具體自動步驟：65下烘干6分鐘。聽到“嘟”聲后，電泳艙蓋解鎖。5.2.6 染色-脫色1

12、.打開電泳艙蓋。2.取下烘干的膠片。3.打開凝膠支架，將膠片面向操作者置于支架上，確定膠片被完好地固定于支架上。4.將支架置于染色艙(染色之前作下述檢查：洗滌液至少400ml；染色液至少300ml；脫色液至少1l；廢液缸空置)。5.選擇“if”染色程序并按右側鍵盤“start”鍵開始。在染色、脫色、和烘干過程中，染色艙始終被鎖定。冷卻之后聽到“嘟”聲，染色艙被解鎖。電泳艙蓋打開后溫度下降至20至少需5分鐘，將點樣支架和電極支架放于原處，取出凝膠支架，此時新一輪電泳即可開始。5.3 結果計算：依次打開電腦主機、掃描儀及打印機。打開掃描儀蓋，將凝膠片背面向上，固定于掃描支架上，置于掃描儀中。啟動h

13、yrys-phoresis光密度掃描系統相應分析軟件，對免疫固定電泳凝膠進行掃描、圖像編輯處理，并輸出免疫固定電泳結果。6 質量控制每批操作過程中應使用sebia公司的質控血清做質量控制。7 干擾因素溶血和不完全凝固標本、嚴重巨球蛋白血癥標本或im多聚體可干擾試驗。8 計算hyrys-phoresis光密度掃描系統會自動地計算出結果。9 實驗室解釋9.1 多發性骨髓瘤：按m蛋白所屬免疫球蛋白類型的不同，多發性骨髓瘤分為若干個亞型：igg型骨髓瘤：此型最為多見(約為60%以上)；iga型骨髓瘤：此型次之(約占30%)；igd型骨髓瘤：較少見(約為1%)；輕鏈型骨髓瘤：占患者的20%；ige型骨髓

14、瘤：此型極為罕見；無分泌型骨髓瘤：約1%。9.2 巨球蛋白血癥：巨球蛋白血癥屬于免疫增殖性疾病，以漿細胞樣淋巴細胞異常增殖(源自b淋巴細胞)，大量分泌單克隆巨球蛋白，并廣泛浸潤骨髓和髓外臟器為特征。本病患者血清中大量igm分子，多以19s(即由五個igm分子亞單位組成)為主，還有一定數量的7s單位。免疫固定所出現的高聚合成分，陷溶在加樣點處的凝膠中，結果在所有的路徑上都形成了沉淀。用-巰基乙醇處理，將導致巨球蛋白體積的縮小，這樣才能使它的遷移成為可能。血清用還原劑處理后，出現了kappa-igm單克隆或lamda-igm單克隆區帶。9.3 重鏈病：重鏈病為漿細胞的惡性增殖性疾患，其特征為所產生

15、的單克隆免疫球蛋白為不完全的重鏈，而無輕鏈合成。從道理上講，人體存在五種免疫球蛋白就有可能產生五種重鏈病。目前已報告的有4種，即、和，常見為前三種：重鏈病：血出現鏈m蛋白，而尿中無輕鏈蛋白，血清中異常蛋白濃度大于2000mg/dl，沉淀系數為3.54.0s，分子量為4580kd；重鏈病：血清中出現鏈m蛋白，而濃縮尿中也可見鏈m蛋白但無輕鏈蛋白；重鏈病：尿中排出大量輕鏈蛋白，血清中鏈m蛋白常不明顯。9.4 輕鏈病：輕鏈病患者常以腎功能損傷而就診，這是由于輕鏈病人的m成分是輕鏈，分子量只有2萬多，極易經腎小球濾過而在腎小管沉積，當腎功能尚好時，血中輕鏈無明顯升高。所以，早期血清免疫電泳常不能出現明

16、顯的異常。但當腎功能損傷，輕鏈不能順利排出時，則血清中輕鏈升高。該m成分做免疫電泳時即與相應的抗ig血清反應，也與抗相應的輕鏈血清發生反應，其沉淀線位置往往前移且與正常ig的沉淀線相連或相切，出現一條附加的沉淀線。此時如改用抗fc血清，該沉淀線消失。診斷輕鏈病時必須排除多發性骨髓瘤伴隨的輕鏈血癥，如igd和ige骨髓瘤，幾乎100%有伴隨輕鏈。9.5 多克隆ig增殖免疫病：多克隆ig增殖是一組其他疾病的伴隨現象，多見于某些慢性炎癥，如慢性肝炎、肝硬化、sle和某些腫瘤。其增殖的ig多為多克隆性，偶有以單一的克隆增殖為主，酷似m蛋白的患者。免疫電泳圖形往往是ig沉淀線增濃增寬或有輕度變形。無論增

17、殖是多克隆還是寡克隆，其電泳圖中的、輕鏈比例不變，與兩者的抗血清皆可出現沉淀線，而與抗形成的沉淀線較稍濃稍長，結合其他檢查，不難排除。10 異常結果處理電泳結果異常需與臨床診斷相符合，不符合的結果應復查或經確診試驗進行確認。11 報告時間與標本保存11.1 免疫固定電泳試驗三天出結果；病房患者的檢驗結果報告單在4天內發回科室，門診病人的檢驗結果報告單在收到標本的第四天下午送到化驗單領取處。11.2 免疫固定電泳試驗檢查過的標本應放28冰箱保存24小時。12 操作性能免疫固定電泳試驗敏感性：氨基黑染色液：iga為25mg/dl；igg為50mg/dl；igm為12mg/dl；輕鏈kap為25mg/dl；輕鏈lam為12mg/dl。結晶紫染色液：iga為25mg/dl；igg為25mg/dl；igm為12mg/dl；輕鏈kap為25mg/dl；輕鏈lam為6mg/dl。免疫固定電泳試驗是一個定性鑒別試驗，目前還沒有其它試驗性能指標。13 參考文獻1 葉應嫵, 王毓三主編. 全國臨床檢驗操作規程. 中華人民共和國衛生部醫政司. 南京.