1、1 第十章第十章 氨基酸與蛋白質類藥物的分析氨基酸與蛋白質類藥物的分析 第一節第一節 概述概述 第二節第二節 氨基酸類藥物的分析氨基酸類藥物的分析 第三節第三節 蛋白質類藥物的分析蛋白質類藥物的分析 2 第一節第一節 概述概述 v一、氨基酸的性質一、氨基酸的性質 v二、蛋白質的性質二、蛋白質的性質 3 一、氨基酸的性質一、氨基酸的性質 v具有具有旋光性旋光性 v光吸收光吸收：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外：酪氨酸、色氨酸、苯丙氨酸，在近紫外 區有最大吸收。區有最大吸收。 v酸堿性酸堿性：兩性電解質，凈電荷為零時的：兩性電解質，凈電荷為零時的pH稱為等稱為等 電點（電點（pI ），）， 生理

2、條件下多數以負離子形式存在生理條件下多數以負離子形式存在 pH = pI 凈電荷凈電荷=0 pH pI 凈電荷為負凈電荷為負 CH R COOH NH3+ CH R COO NH2 CH R COO NH3+ + H+ + OH- + H+ + OH- (pK 1)(pK 2) 當氨基酸溶液在某一定當氨基酸溶液在某一定pH值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負值時，使某特定氨基酸分子上所帶正負 電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此電荷相等，成為兩性離子，在電場中既不向陽極也不向陰極移動，此 時溶液的時溶液的pH值即為該氨基酸的值即為該氨基酸的等電點等電點(isoelectr

3、ic point，pI)。 1.1.兩性解離和等電點兩性解離和等電點 一、氨基酸的性質一、氨基酸的性質 Trp Tyr Phe 的的 紫紫 外外 吸吸 收收 光光 譜譜 摩爾吸收系數摩爾吸收系數 波長波長 2.2.光學性質光學性質 a. a. 與茚三酮反應與茚三酮反應: :用于氨基酸定量定性測定用于氨基酸定量定性測定. . b.b.與與2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)反應反應(sanger(sanger反應反應):): 用于蛋白質用于蛋白質N-N-端測定端測定。 c. c. 與苯異硫氰酯（與苯異硫氰酯（PITCPITC）反應）反應(Edman(Edman反應反應)

4、)， 用于蛋白用于蛋白N-N-端測定，蛋白質順序測定儀設計原理端測定，蛋白質順序測定儀設計原理 依據。依據。 3.3.重要化學反應重要化學反應 氨基酸與茚三酮反應氨基酸與茚三酮反應 + 3H20 水合茚三酮水合茚三酮(無色無色) NH3 CO2 RCHO + 還原性茚三酮還原性茚三酮 紫色化合物紫色化合物 (弱酸弱酸) 加熱加熱 水合茚三酮水合茚三酮 + 2NH3 + 還原性茚三酮還原性茚三酮 氨基酸與氨基酸與2,42,4一二硝基氟苯一二硝基氟苯(DNFB)(DNFB)的反應的反應 （sangersanger反應）反應） DNFB（dinitrofiuorobenzene） DNP-AA(黃色

5、黃色) + + HF 弱鹼中弱鹼中 氨基酸氨基酸 氨基酸與苯異硫氰酯（氨基酸與苯異硫氰酯（PITCPITC）的反應）的反應 （EdmanEdman反應）反應） PITC（phenylisothiocyanate） + 苯乙內酰硫脲衍生物苯乙內酰硫脲衍生物(PTH-AA) （phenylisothiohydantion-AA） 弱鹼中弱鹼中 (400 C) (硝基甲烷硝基甲烷 400 C) H+ 二、蛋白質的性質二、蛋白質的性質 v蛋白質蛋白質(protein)是由許多氨基酸是由許多氨基酸(amino acids)通過肽鍵通過肽鍵(peptide bond)相連形成的相連形成的 高分子含氮化合物

6、高分子含氮化合物。 2.1蛋白質為什么能作為藥物蛋白質為什么能作為藥物? 1）作為生物催化劑（酶）作為生物催化劑（酶） 2）代謝調節作用）代謝調節作用(胰島素調節血糖胰島素調節血糖) 3）免疫保護作用）免疫保護作用(白介素和干擾素白介素和干擾素) 4）物質的轉運和存儲）物質的轉運和存儲 5）運動與支持作用）運動與支持作用 6）參與細胞間信息傳遞）參與細胞間信息傳遞 2.2 蛋白質元素組成的特點：蛋白質元素組成的特點： v各種蛋白質的含氮量很接近，平均為各種蛋白質的含氮量很接近，平均為16。 v100克樣品中蛋白質的含量克樣品中蛋白質的含量 ( g % )= 每克樣每克樣 品含氮克數品含氮克數

7、6.25100 2.3 蛋白質的基本單位蛋白質的基本單位-氨基酸氨基酸 氨基酸的分類：氨基酸的分類： v非極性側鏈氨基酸非極性側鏈氨基酸 v非電離極性側鏈氨基酸非電離極性側鏈氨基酸 v酸性氨基酸酸性氨基酸 v堿性氨基酸堿性氨基酸 14 2.4 蛋白質的性質蛋白質的性質 n 高分子有機物高分子有機物 n 蛋白質膠體性質蛋白質膠體性質 n 兩性解離性質及等電點兩性解離性質及等電點 n 蛋白質的紫外吸收特性蛋白質的紫外吸收特性 n 蛋白質呈色反應蛋白質呈色反應 15 蛋白質為高分子有機物蛋白質為高分子有機物 v蛋白質水溶液具有親水膠體的性質，還蛋白質水溶液具有親水膠體的性質，還 具有擴散和具有擴散和

8、沉降沉降作用，粘度大和不透過作用，粘度大和不透過 半透膜半透膜等。等。 v沉降常數（沉降常數（S）：）： v擴散常數（擴散常數（D）：）： v粘度：在一定溶質濃度下，取決于溶質粘度：在一定溶質濃度下，取決于溶質 的分子量和形狀。的分子量和形狀。 16 蛋白質為兩性電解質蛋白質為兩性電解質 v蛋白質分子至少具有一個自由氨基和蛋白質分子至少具有一個自由氨基和 一個自由羧基，具有一個自由羧基，具有兩性解離性質兩性解離性質。 v蛋白質電泳、離子交換。蛋白質電泳、離子交換。 蛋白質主要呈色反應蛋白質主要呈色反應 雙縮脲反應雙縮脲反應 酚試劑反應酚試劑反應 蛋白質定量、定性蛋白質定量、定性 茚三酮反應茚三

9、酮反應 測定常用方法測定常用方法 18 雙縮脲反應雙縮脲反應 v雙縮脲試劑的成分雙縮脲試劑的成分: :堿性硫酸銅溶液。堿性硫酸銅溶液。 v堿性溶液中，堿性溶液中，雙縮脲雙縮脲( (H H2 2NOCNOCNHNHCONHCONH2 2) )能與能與 CuCu2+ 2+作用，形成紫色或紫紅色的絡合物。 作用，形成紫色或紫紅色的絡合物。 19 Folin 酚反應（酚反應（Lowry） v 包括兩步反應：包括兩步反應： v（1）在堿性條件下，與銅試劑作用生成）在堿性條件下，與銅試劑作用生成蛋蛋 白質銅絡合物白質銅絡合物； v（2）此絡合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，）此絡合物將磷鉬酸、磷鎢酸試劑還原，

10、 生成深藍色混合物，顏色深淺與蛋白含量生成深藍色混合物，顏色深淺與蛋白含量 成正相關。成正相關。 v660nm測定，靈敏度比雙縮脲法高測定，靈敏度比雙縮脲法高100倍。倍。 適于微量蛋白的測定。適于微量蛋白的測定。 蛋白質的紫外吸收光譜蛋白質的紫外吸收光譜 蛋白質在遠紫外光蛋白質在遠紫外光 區（區（200-230nm200-230nm）有較）有較 大的吸收，在大的吸收，在280nm280nm有有 一特征吸收峰，可利用一特征吸收峰，可利用 這一特性對蛋白質進行這一特性對蛋白質進行 定性定量鑒定。定性定量鑒定。 蛋白質質量濃度蛋白質質量濃度/（mg/ml）=1.55A1cm - 0.76A1cm

11、280 260 測定范圍：測定范圍：0.10.5mg/ml 21 第二節第二節 氨基酸類藥物的分析氨基酸類藥物的分析 v一、氨基酸鑒別一、氨基酸鑒別 v二、氨基酸定量二、氨基酸定量 22 一、氨基酸鑒別一、氨基酸鑒別 v茚三酮茚三酮：溶液均顯藍紫色。：溶液均顯藍紫色。 v旋光性旋光性： v薄層色譜鑒別法薄層色譜鑒別法 ： v紫外光譜鑒別紫外光譜鑒別：酪氨酸、色氨：酪氨酸、色氨 酸、苯丙氨酸，在紫外區有最酸、苯丙氨酸，在紫外區有最 大吸收。大吸收。 v紅外光譜鑒別紅外光譜鑒別：壓制成溴化鉀：壓制成溴化鉀 片，在片，在4000667 cm-1范圍內范圍內 測定吸收圖譜。測定吸收圖譜。 23 二、氨

12、基酸定量二、氨基酸定量 v（一）（一）茚三酮法茚三酮法 v（二）三硝基苯磺酸法（二）三硝基苯磺酸法 v（三）銅復合物紫外吸收法（三）銅復合物紫外吸收法 v（四）（四）甲醛滴定法甲醛滴定法 v（五）（五）非水溶液滴定法非水溶液滴定法 v（六）（六）雙波長分光光度法雙波長分光光度法 v（七）（七）導數分光光度法導數分光光度法 v（八）（八） HPLCHPLC法法 24 （一）茚三酮法（一）茚三酮法 v茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應，氨基酸被氧化茚三酮在酸性條件下和氨基酸反應，氨基酸被氧化 分解生成醛，放出氨和二氧化碳，分解生成醛，放出氨和二氧化碳，還原型茚三酮還原型茚三酮。 v還原型茚三酮與氨及另

13、一分子茚三酮縮合生成藍紫還原型茚三酮與氨及另一分子茚三酮縮合生成藍紫 色的物質，最大吸收值波長色的物質，最大吸收值波長570 nm。 v范圍：范圍：0.5-50g 25 （二）三硝基苯磺酸法（二）三硝基苯磺酸法 vTNBS在偏堿性的條件下與氨基酸反應，先在偏堿性的條件下與氨基酸反應，先 形成形成中間絡合物中間絡合物。 v酸性溶液中，中間絡合物轉化成酸性溶液中，中間絡合物轉化成TNB-氨基氨基 酸酸，吸收值移至，吸收值移至340nm處。處。 26 （三）銅復合物紫外吸收法（三）銅復合物紫外吸收法 v在合適的在合適的pH條件下，二分子條件下，二分子-氨基酸與一分子氨基酸與一分子 銅離子形成銅離子形

14、成氨基酸氨基酸-銅復合物銅復合物。 v復合物呈藍色，除了在復合物呈藍色，除了在620nm有吸收峰外，在有吸收峰外，在 230nm有最大吸收有最大吸收 v蛋白質水解速度和蛋白質水解速度和水解程度水解程度的測定。的測定。 27 （四）甲醛滴定法（四）甲醛滴定法 v在在pH中性下，甲醛迅速與氨基酸上的氨基結中性下，甲醛迅速與氨基酸上的氨基結 合，使平衡合，使平衡向右移動向右移動，促進氫離子釋放，使，促進氫離子釋放，使 溶液酸度增加。溶液酸度增加。 v每釋放出一個氫離子，相當有一個每釋放出一個氫離子，相當有一個氨基氮。氨基氮。 28 （五）非水溶液滴定法（五）非水溶液滴定法 v非水溶液滴定法：是氨基酸

15、在非水溶液滴定法：是氨基酸在冰醋酸中冰醋酸中用用高高 氯酸的標準溶液氯酸的標準溶液滴定其含量。滴定其含量。 v酸堿的質子學說：一切能給出質子的物質為酸堿的質子學說：一切能給出質子的物質為 酸，能接受質子的物質為堿。酸，能接受質子的物質為堿。 v弱堿在酸性溶劑中堿性顯得更強弱堿在酸性溶劑中堿性顯得更強，而弱酸在，而弱酸在 堿性溶劑中酸性顯得更強。堿性溶劑中酸性顯得更強。 v適合適合成品成品測定，測定范圍是幾十毫克。測定，測定范圍是幾十毫克。 29 非水溶液滴定法非水溶液滴定法 v直接滴定法直接滴定法：適用于能：適用于能溶于溶于冰醋酸的氨基冰醋酸的氨基 酸。丙氨酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、酸。丙氨

16、酸、精氨酸、組氨酸、亮氨酸、 苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸等。苯丙氨酸、色氨酸、蘇氨酸等。 v回滴法回滴法：適用于不能：適用于不能溶于冰醋酸而能溶于溶于冰醋酸而能溶于 高氯酸高氯酸的氨基酸。賴氨酸、絲氨酸、半胱的氨基酸。賴氨酸、絲氨酸、半胱 氨酸等。氨酸等。 30 （六）（六）雙波長分光光度法雙波長分光光度法 v消除共存組分干擾消除共存組分干擾 v等吸收波長的選擇等吸收波長的選擇:復方氨基酸復方氨基酸 注射液在注射液在320280 nm范圍內，范圍內， 只有只有色氨酸和酪氨酸色氨酸和酪氨酸有吸收度。有吸收度。 v酪氨酸在酪氨酸在280，303.2波長處吸波長處吸 收度相等，收度相等，選用選用280

17、與與303.2nm 為等吸收波長為等吸收波長。 31 標準曲線的繪制標準曲線的繪制 v精密吸取精密吸取1.2，2.0，3.0，4.0，5.0， 6.0ml色氨酸對照品色氨酸對照品溶液，置溶液，置100 ml 量瓶中，用氫氧化鈉液稀釋至刻度，量瓶中，用氫氧化鈉液稀釋至刻度， 在在280，303.2nm處分別測定，計算處分別測定，計算 吸收度差值吸收度差值A 。 v在在0.53.0mg/100ml范圍，范圍，濃度與吸濃度與吸 收度差值呈良好性關系收度差值呈良好性關系。 32 （七）、（七）、導數分光光度法導數分光光度法 v選定導數光譜波長范圍為選定導數光譜波長范圍為322270nm，按導數分光按導數分光 光度法測定色氨酸、酪氨酸的一階，二階和三階導光度法測定色氨酸、酪氨酸的一階，二階和三階導 數光譜。數光譜。 v在在三階導數光譜三階導數光譜中色氨酸在中色氨酸在287、284、280nm有三有三 個導數光譜峰，而酪氨酸在零線上，選定三階導數個導數光譜峰，而酪氨酸在零線上，選定三階導數 分光光度法。分光光度法。 33 標準曲線繪制標準曲線繪制 v對照品對照品色氨酸色