1、1 大鼠灌注固定取腦 . 2 用途 1.用于常規HE染色，免疫組化分析。 2.冰凍切片可以不做腦組織固定。 3.不可用于western blot和PCR。 4.如果觀察腦組織的缺血、損傷或其它病變時，不作灌注 固定，而是在取出腦組織后作固定，將大大影響效果。 . 3 原理原理 心臟灌流術能夠快速沖凈血液并在動物 死 亡前進行組織的前固定,避免了組織的自 溶 現象,是腦組織切片觀察的常用方法。多 聚 甲醛使組織蛋白發生交聯，以保持蛋白 的 原位和表面結構不變，從而能使其對應 的抗體，準確檢測其表達的位置和量。 . 4 必要性必要性 1.腦組織較軟，且細胞成分不易保留，腦組織是較易軟化的組織之一，

2、血供 也較為豐富，所以最好是在取腦組織前用4多聚甲醛灌注固。 2.經前固定后，取腦操作時，可減少腦組織損傷。 3.腦內血液都在，HE染色后，可去除紅細胞背景影響 . 5 流程流程 麻醉 開胸 心尖向左心室穿針 剪開右心耳 生理鹽水沖洗 4%多基甲醛固定 取腦 保存或切片. . 6 具體過程 大鼠經深度麻醉后，固定于自制的手術木 板置于解剖盤中,開胸暴露并游離出心臟,經 左心室插入灌流針并固定, 切開右心耳,先灌 注冰凍無菌生理鹽水(4)XmL，直到肝和肺 臟顏色轉白及右心房流出液澄清,后再灌注 冰凍(4)4%多聚甲醛XmL,斷頭取腦,多聚甲 醛浸泡固定24小時。 . 7 1.多聚甲醛的配置：

3、一般方法為：4多聚甲醛PBS緩沖液配法：稱取40g PFA溶于裝 有500mlDEPC水的玻璃容器燒杯或燒瓶）中，持續加熱磁力攪 拌至6065，使成乳白色懸液。用1.0mol/L的NaOH值至7.4， 使呈清亮狀（滴加），再加入約500ml PBS，充分混勻（在冰浴 或冷水浴中），可再檢測一下pH，過濾后定容至1000ml，室溫 或4保存備用。 簡便方法：先配好PBS，稱好相應的多聚甲醛，37水浴或溫箱 密封放置2天，就能全溶。若是很急，55水浴一天，期間不時 震蕩。注意，4%的多聚甲醛需臨用前配制,配制后需過濾去除小的 雜質,避免心臟灌流時造成栓塞影響灌流效果。 也可用10%福爾馬林溶液，甲

4、醛1：10稀釋 甲醛100ml 磷酸二氫鈉4g 磷酸氫二鈉6.5g 蒸餾水900ml 或甲醛100ml加900mlPBS緩沖液。 . 8 2.制作灌注裝置，用兩瓶塑料包裝的輸液瓶裝灌注液。同時配好輸液器備用。 3.10水合氯醛按4mL/100g的劑量腹腔注射麻醉動物。 4.沿兩側肋弓剪開皮膚，打開腹腔，用止血管鉗夾持劍突并向上提拉，用彎 剪在膈肌與胸骨柄相連處剪一小口，造成人工氣胸，然后向兩側順延，剪斷 膈肌及肋骨，夾持劍突的血管鉗將劍突連帶胸廓上翻固定，充分暴露心臟， 直視下穿刺針左心室心尖處，用血管鉗固定。 5.快速滴注生理鹽水(室溫)，同時剪開右心耳。約注入100150mL，至流出液 體

5、血色較淺基本澄清，停止灌注。肝臟、眼珠、爪子迅速變白是排出血液的 有效觀察指標。 6.繼續用4%多聚甲醛灌流250ml固定。 7.后固定：灌流后的腦組織置于4PFA置4度冰箱內進行后固定，時間2h， 過夜最好 . 9 省省時省劑的方時省劑的方法法 夾閉腹主動脈：只灌注上肢及頭腦，固定 的好又快，又省試劑。先灌注生理鹽水 約100ml，見到老鼠兩前肢及兩肺變白即可改 灌注多聚甲醛。多聚甲醛用100ml以下即可。 灌注成功的標志：剛開始灌注時老鼠前肢劇 烈抽動（下肢不抽動證明腹主動脈夾閉完 全）；前肢及頸部僵硬；所灌注的腦組 織白而硬 . 10 大鼠腦組織取材步驟大鼠腦組織取材步驟 1.剪開皮膚

6、. 11 2.用鉤鑷再眼眶處固定大鼠顱骨，用組織剪 再顱骨和頸椎連接處剪斷 . 12 3.組織剪頭部伸入枕骨大孔，盡量貼著骨頭（不能插太深傷到腦組織）。 . 13 4.組織剪從枕骨大孔處伸入，朝向同側眼眶 方向，貼著骨頭剪，剪到眼眶 . 14 5.從大鼠眼眶之間剪斷 . 15 6.左手持鉤鑷插入大鼠的眼眶固定顱 骨，用彎鉗直接夾住枕骨大孔處的骨 頭直接就掀起來了 . 16 從小腦處將腦組織向上推起，用小 剪刀剪斷腦神經 . 17 注意事注意事項項 1.多聚甲醛氣味刺激，配置時做好自我保護。 2.暴露心臟這一步驟，容易損傷肺、心臟或者肝臟，“夾持 劍突并向上提拉，用彎剪在膈肌與胸骨柄相連處剪一小

7、口， 造成人工氣胸”，人工氣胸后，肺萎縮，胸腔里的空間增大， 提拉劍突后，不容易損傷肺、心及肝臟，出血少。 3.經心臟灌注，有時穿刺針會誤進右心室，那樣灌注主要在 肺循環起作用，體循環的血液影響不大。所以觀察將穿刺針 插入到主動脈內可以確保起到體循環灌注沖洗血液的效果， 腦組織的血液沖干凈后，才不會影響免疫組化的效果，不然 到處都是紅細胞造成的背景染色。 4.灌注時注意排空輸液管中的氣泡，不然容易氣栓，影響灌 注效果。一定要看到大鼠較劇烈抽搐，不然證明灌注不好。 . 18 5.關于生理鹽水的溫度的選擇，有人認為因 為是快速沖刷血管里的血液，低溫造成血 管收縮，灌注的效果反而沒有室溫的好。 但是

8、用低溫的認為，低溫有利于組織完整。 6.灌注成功的標志：剛開始灌注時老鼠劇烈 抽動；成功后老鼠后肢繃直，尾部豎起成 一直線；所灌注的腦組織白而硬。 7.去顱骨后腦表面有一層硬腦膜,要去掉。 . 19 常見問題 . 20 1.灌注取腦不可用于Western blot及PCR的原因 多聚甲醛使組織蛋白發生交聯，以保持蛋白的原位和 表面結構不變，從而能使其對應的抗體，準確檢測其 表達的位置和量。 Western中，要用去污劑使各種蛋白發生變性、解聚， 并變成統一的線性肽鏈，從而能夠用凝膠電泳進行分 子量的梯度分離。多聚甲醛會影響蛋白的解聚，從而 使其無法用凝膠分離。 另外，WB和免疫組化所使用 抗體

9、的抗原表位也不同，WB的抗體一般識別蛋白的 一級結構，所以可能也無法識別甲醛處理的蛋白。 PCR要提RNA，RNA非常容易降解，必須新鮮取組織， 然后盡快超低溫冷藏或者馬上抽提，否則非常容易降 解。灌注固定的組織，原則上是能夠提得出DNA和RN A的，但是肯定會有較多的降解，一般不會這樣做。 . 21 2.沒有灌注固定的大鼠腦組織,能不 能做切片和免疫組化？ 如果沒有灌注固定，而是直接取材然后放 入固定液中，可以進行免疫組化染色，只 是效果不如灌注固定的好 尤其是要做電鏡時更明顯。有的標記蛋白 要求較高，固定不好就難以染好。 . 22 3.用4%多聚甲醛固定但保存了2周才做石蠟切 片，對免疫組

10、化有無影響？ 固定時間過長蛋白多肽鏈都交連在一起了,抗原性就 很弱了，很可能沒有陽性結果,抗原修復時一般的修復很 難把抗原性恢復. 可能會有影響，但不會太大。固定時間 長，抗原修復時間也要長一些。 . 23 4.灌注多長時間？灌注液多少？ 每個人的灌注液用量都不一樣，灌注速度 也能沒有很清楚的說法，灌注時間也不確 定。主要還是看灌注成功的標志。現將看 到的比較詳細的處理方法列出。灌注速度， 大家比較公認的是先快后慢。 . 24 短期灌注：采用心臟穿刺快速灌注20 min,其中生理鹽水灌注5010 0mL,4 %多聚甲醛緩沖液灌注150 mL。 長期灌注：灌注時間延長到1 h,其中生理鹽水灌注2

11、00mL,4 %多聚 甲醛緩沖液灌注400 mL。 短期灌注組腦組織結構保留基本良好,與長期灌注組相比稍差,研究 皮層和海馬結構損傷基本可以滿足;長期灌注組結構保留最好,但是 耗時長、固定液用量大,致使試驗進度慢等缺點不容忽視。,對皮層 和海馬缺血再灌注損傷研究選擇短期灌注取腦尚可滿足需要,深部 腦白質及核團缺血再灌注損傷研究還是要用長期灌注固定取腦法, 或者在取腦后立即根據實驗取材要求將腦切成塊再浸泡入固定液 充分固定。 下面是夾閉腹主動脈: 每只大鼠先快速推注生理鹽水50 ml沖洗,繼而灌注固定液(如4%多 聚甲醛等)5080 ml,先快后慢,需1015 min,在灌注固定液過程中,頸 部逐漸變硬;灌注結束后,開顱取出腦組織,置于固定液中后固定24 h . 25 5.體循環與肺循環的鑒別 體循環時大鼠肝臟變白現象出