1、.1. 非編碼rna的分類及概念1.1 分類非編碼rna(non-coding rna)是指轉錄組中不翻譯為蛋白質的rna分子。包括相對分子量較小的 核內小分子rna(small nuclear rna，snrna)、核仁小分子rna(small nucleolar rnas，snorna)、微rna(microrna，mirna)、piwi-interacting rna(pirna)干擾小rna（small interfering rna，sirna）以及相對分子量較大的 長非編碼rna(long non-coding rna，lncrna)等。1.2 概念：snrna：核內小分子rna(

2、small nuclear rna)，它是真核生物轉錄后加工過程中rna剪接 體（spliceosome）的主要成分，參與mrna前體的加工過程。snorna：核仁小分子rna（small nucleolar rnas），它在核糖體rna 的生物合成中發揮作用，另外還能夠指導snrna、trna 和mrna 的轉錄后修飾。mirnas：微小rna（micrornas），是一類由內源基因編碼的長度約為22 個核苷酸的非編碼單鏈rna 分子，通過與靶標mrna的3 端非翻譯區(3-untranslated region，3-utr)特異性結合，從而引起靶標mrna分子的降解或翻譯抑制，在動植物中參

3、與轉錄后基因表達調控。pirnas（piwi-interactingrna）：pirna基因是一類長度為2432 nt的的單鏈小rna，有很強的正義鏈和反義鏈專一性，其5 端第一個核苷酸有尿嘧啶傾向性，3 端被2-o-甲基化修飾，這類末端修飾可防止成熟體pirna基因降解.pirna主要與piwi亞家族成員piwi蛋白或ago3蛋白質結合而發揮作用。sirna ：干擾小rna（small interfering rna），是一種小rna分子，由dicer酶加工而成。雙鏈rna經酶切后會形成很多小片段，sirna是sirisc的主要成員，激發與之互補的目標mrna的沉默。精品.lncrna：長鏈

4、非編碼rna（long non-coding rna），lncrna是長度大于 200 個核苷酸的非編碼 rna。研究表明， lncrna 在劑量補償效應、表觀遺傳調控、細胞周期調控和細胞分化調控等眾多生命活動中發揮重要作用，成為遺傳學研究熱點。mirna和sirna的區別主要有兩點：（1）mirna是內源性的，是生物體基因的表達產物；sirna是外源性的，來源于病毒感染、轉座子或轉基因靶點。（2）mirna是由不完整的發卡狀雙鏈rna，經drosha和dicer酶加工而成；sirna是由完全互補的長雙鏈rna，經dicer酶剪切而成。圖：莫小燕等，非編碼rna在腫瘤細胞糖代謝中的調控作用1.

5、3 sirna、mirna及pirna的生物合成 3a： (人類)sirna來源于長的雙鏈rna分子,經dicer酶剪切為21-25nt的雙鏈rna片段，dicer酶和dsrna結合蛋白將sirna二聚體裝載至argonaute 蛋白（ago2）而發揮作用；b：(人類)mirna由內源性的生物體基因產生含有發卡結構的65-70nt 長的pri-mirna，該發卡結構在細胞核內經drosha-dgcr8復合物加工產生pre-mirna。在細胞漿內， pre-mirna進一步經dicer酶剪切為mirna-mirna*二聚體（其中mirna為引導鏈，mirna* 為信息鏈），裝載至argonaut

6、e 蛋白1(ago1) 而發揮作用。c：(鼠類) pirna 的生物合成尚不清楚。pirna來源于單鏈rna 前體，而且不依賴于dicer酶。產生的初級正義pirna傾向于與 mili結合，在出生前的睪丸、mili 和miwi2 均參與復制周期，在次級反義pirna中miwi2 比mili 更為豐富，次級反義pirna可能直接裂解轉座子mrna。精品.圖：于紅，表觀遺傳學:生物細胞非編碼rna調控的研究進展2、microrna的功能2.1 mirna參與細胞自噬調控1。在自噬的啟動(induction)、囊泡成核(vesicle nucleation)、囊泡延伸(vesicle elongat

7、ion)、自噬回收(retrieval)與囊泡融合(fusion)等幾個階段中均參與調控。此外，mirna也可通過其他方式調節細胞自噬。直接調控，直接作用的位點目前發現有:對stmn1基因（該基因編碼的stathmin蛋白被發現參與自噬調控）， dram2 ，irgm，線粒體自噬受體fundc1和nix等。間接調控，即通過對細胞分子通路中重要的調控性蛋白進行調控，從而間接地調控自噬的過程。調控靶點有：smad4，foxo3，atm，runx3，p53；ezh2，pi3k/akt通路，hnrnp a1，egfr等。精品.圖：陳月琴等，非編碼rna與細胞自噬調控2.2 參與表觀遺傳調控3mirna

8、可通過調控組蛋白修飾引起染色質重塑。即mirna可通過調控組蛋白的修飾而參與tgs。mirna還可通過調控dna甲基化酶的表達而影響dna甲基化參與tgs。2.3 在腫瘤中的調節機制42.3.1 對致癌基因的調節。在腫瘤細胞中表達水平升高的mirna被認為是致癌基因，通過抑制抑癌基因和（或）抑制控制細胞分化和凋亡的基因來促進腫瘤進展。首先，mir-17-92群簇被認為在腫瘤細胞調節中起重要作用，mir-17-92群簇可能通過調節兩個抑癌基因-pten和視網膜母細胞瘤基因（rb）家族的成員甙rb2/ p130的基因促進腫瘤進展。pten通過pi3k-akt / pkb通路促進凋亡。其次，mir-

9、17-92群簇對細胞周期和增殖的作用部分是通過對e2f轉錄因子基因調節實現。最后，mir-17-92群簇通過arf-p53基因通路抑制細胞凋亡，進而促進腫瘤的發展。此外，mir-372和mir-373是另外兩個致癌的mirna，通過直接抑制抑癌基因lats2的表達來解除的p53介導的對細胞周期依賴性蛋白激酶（cdk）的抑制，進而促進細胞增殖和腫瘤進展。人類睪丸生殖細胞腫瘤的發生中涉及這一機制。精品.2.3.2對抑癌基因的調節。在腫瘤細胞中表達水平降低的mirna的被認為是抑癌基因，通過抑制致癌基因和（或）抑制控制細胞分化和增殖的基因來抑制腫瘤進展。let-7的家族的mirna的在許多腫瘤中表達

10、下調，其作用的靶基因可能是ras致癌基因，包括肺癌和乳腺癌.mir-29家族成員通過靶向結合抗凋亡蛋白基因mcl1和致癌基因tcl1表現出抑癌作用。此外，在白血病患者、垂體腺瘤患者中mir-15和mir-1均表現出表達的抑制。2.4 參與糖代謝的調控62.4.1 mirna通過調控己糖激酶基因表達影響腫瘤細胞的糖代謝。乳腺癌細胞中白介素-6（il-6）和mir-155均可通過上調hk2基因表達來促進糖酵解。而mir-125a/ b和mir-143是hk2的反向調節者。2.4.2 mirna通過調控磷酸果糖激酶基因表達影響腫瘤細胞的糖代謝。人肺腺癌中肌型磷酸果糖激酶（pfkm）和糖酵解均上調，而

11、mir-320a可以下調pfkm表達。研究發現，另一種mirna-mir-520s可以下調pfkp表達。這說明有多種mirna可以通過調節磷酸果糖激酶來調控腫瘤細胞的糖代謝。2.4.3 mirna通過調控丙酮酸激酶基因表達影響腫瘤細胞的糖代謝。研究發現， pkm2 mrna是mir-122的直接作用靶點，而mir-122通過調節pkm2的量來調控腫瘤細胞的糖代謝。3. sirna參與表觀遺傳調控3精品.sirna 能在哺乳動物細胞中介導 dna 甲基化和組蛋白修飾，從而導致轉錄基因沉默（tgs）。目前研究表明：argonautes 蛋白家族 (ago1 及 ago2 )，dnmt 3a，組蛋白

12、去乙酰化酶（histone deacetylase-1, hdac-1）和/或 polycomb 蛋白家族 ( polycomb group, pcg )的 ezh2 ( enhancer of zeste homolog 2 ) 參與了sirna 誘導的 tgs。ago 在 tgs 中的作用早于靶標啟動子的組蛋白甲基化，當靶標沉默態組蛋白修飾 ( h3k9 甲基化 ) 增加時，ago-1 明顯減少， 證明 ago1 及 rnapii 對 h3k9 的雙甲基化是必需的。tgs 的建立與維持需要多種不同的蛋白：通常 ago1、dnmt3a 及 hdac-1 對于起始的沉默是必需的，而 dnmt1

13、 對于維持沉默是必需的。4. pirna 參與表觀遺傳調控哺乳動物細胞 pirna 分為兩個亞簇：一是粗線期 pirna 簇：主要出現于減數分裂的粗線期，持續表達至單倍體精子細胞階段，一般很少有重復片段；二是粗線前期 pirna 簇：主要出現于減數分裂前的生殖細胞，雖然具有粗線期 pirna 簇的分子特征，但來源于一個完全不同的簇，具有重復片段。4.1 pirna 相關的 dna 甲基化3pirna 的生物合成假說有兩個，一是 pirna 由長單鏈分子產生；二是 pirna 可能為初級轉錄產物。哺乳動物細胞的基因簇并非初級 pirna 的主要來源，而是由轉座子 mrna 產生初級正義 pirn

14、a 參與擴增循環。dna甲基酶家族（dnmt3a、dnmt3b及dnmt3l）在轉座子甲基化的形成中起主要作用。piwi/pirna復合體能介導轉座子甲基化的形成，且piwi途徑位于dna甲基化調節因子的上游，pirna是生殖細胞內dna甲基化的特異性決定子。4.2 pirna 參與染色體組裝5 pirna基因在調節染色質組裝的過程中發揮了引導作用，即 pirna 基因可募集 piwi 蛋白，hp1a，組蛋白甲基轉移酶su（var）3-9 等表觀調控因子到基因組的特異位點，并阻止rna聚合酶與基因組結合。5. lncrna的功能 lncrna有多種不同的來源，目前認為可能是（1）編碼蛋白的基因

15、結構中斷而轉變為lncrna；（2）染色質重組的結果，即兩個未轉錄的基因與另一個獨立的基因并列而產生含多個外顯子的lncrna；（3）由非編碼基因復制過程中的反移位產生；（4）由局部的串聯復制子產生鄰近的非編碼rna；（5）基因中插入一個轉座成分而產生有功能的非編碼rna精品.3。5.1 參與細胞調控。長非編碼rna在轉錄起始的調控、轉錄及轉錄后的調控中發揮著重要作用，因而影響著各種各樣的生物學過程，比如，劑量補償、基因印跡、細胞周期、發育、配子形成等過程。分子機制：圖：陳曉敏等，長非編碼rna研究進展誘餌分子：長非編碼 rna 通過結合目標蛋白或 mirna 從而稀釋了目標分子在細胞內的水平

16、，進而影響其功能。導向作用：通過與目標分子的結合，長非編碼 rna 能指引核糖核蛋白復合體定位至特異的目標區域，作用方式可以是順式也可以是反式。反式作用：通過與 rna 聚合酶作用以輔助轉錄的方式或者作為一些小的調節rna 分子的互補配對靶分子；順式作用：通過與目標 dna 分子結合形成 rnadna 異源雙鏈核酸分子，或者 rnadnadna 異源三鏈核酸分子，或者rna識別特異染色質的復合物表面特征，引導目標基因附近的染色質改變。分子支架：lncrna 的不同功能域可以結合不同的蛋白質復合體，從而提供類似分子支架的功能，以引導相關的不同類型的大分子復合體在目標區域組裝以協同發揮調控作用。精

17、品.lncrna 與 mirna 轉錄后相互作用方式：圖：陳曉敏等，長非編碼rna研究進展(a) mirna 介導長非編碼 rna 降解； (b) lncrna 通過誘捕或 mirna 海綿作用拮抗mirna；(c) lncrna-mirna 競爭性結合 mrna；(d) lncrna 作為 mirna 前體。此外，長非編碼rna還在人體發育中起到重要的作用，包括：中樞神經系統發育過程調控、心臟發育、骨骼肌發育、皮膚、造血以及脂肪發育、細胞重編程等。長非編碼rna還在表觀遺傳方面起著調控作用2。lncrna的參與細胞調控的方式：通過與單一蛋白質或蛋白復合體結合，同時識別dna/rna序列，從而

18、幫助蛋白復合體進行特異性位點的調控；或是充當分子支架，在蛋白復合體的形成過程中起到重要的作用；此外還有一種競爭性內源rna(competing endogenous rnas, cerna)途徑，是指cerna可以通過競爭性地結合mirna來調節基因的表達。lncrna參與細胞自噬的調控：在3bdo藥物的存在下，flj11812（位于基因tgfb2的3utr區的lncrna）介導mtor通路的激活，細胞自噬則受到抑制。激活的mtor增加了rna結合蛋白tia1的磷酸化水平，而tia1在flj11812的加工過程中起到了重要的作用。進一步研究發現，flj11812可以通過cerna的途徑與atg

19、13競爭性的結合mir-4459，從而達成其對自噬的調節作用。精品.此外，兩個lncrna被發現在癌癥中調節細胞自噬：meg3在膀胱癌細胞中抑制自噬；過表達的hulc在胃癌細胞中被發現能夠促進細胞自噬。15.2 參與調節表觀遺傳lncrna通過參與基因組印記( genomic imprinting) 和x染色體失活( x chromosome inactive)控制表觀性狀，參與的這兩個過程分別與h19和xist rna密切相關。近來有學者在人和鼠細胞中發現h19 rna是 mir-675的前體，提示h19 rna 可能通過mirna發揮基因調控作用。基因組印記除了與h19基因簇有關，還有kc

20、nq1ot1、air及 nespas基因的參與。xist rna(17 kb長的非編碼rna)對于哺乳動物細胞內x染色體失活非常重要，但xist并不輸送至胞漿，而是與即將被它失活的x染色體的某個rna結構域或成分相連，在失活染色體表面形成“外套”并以順式方式介導基因沉默。近來研究表明x染色體失活和基因組印記可能共享一些基因簇，其基因沉默的機制不僅包括順式作用，還有反式作用。另有研究報道：x染色體失活尚存在另一機制，即xist和tsix 復性形成rna二聚體，經dicer酶剪切成為小干擾rna， 其對于失活的x染色體上異染色質的修飾是必需的。這兩個不同的途徑或許可以協調 lncrna和小rna在

21、染色質重塑方面的作用，同時提示rna調控存在著一個更為復雜的、交互的網絡3。此外，lncrna在組蛋白修飾中發揮作用。lncrna可以通過自身形成的莖環結構與核心蛋白抑制復合體prc2結合，后者促進組蛋白h3第27位賴氨酸殘基甲基化。lncrna不僅能引發組蛋白修飾，也能調節組蛋白的去修飾，位于hoxc位點的lncrna-hotair如同分子支架，其5 末端區域與 prc2 結合，3 末端區域與組蛋白賴氨酸特異性脫甲基酶1（lsd1）結合，將兩個功能截然不同的組蛋白修飾物鏈接到特殊的作用位點，以調節組蛋白的修飾過程。部分lncrna參與基因分子的選擇性剪接，特里帕蒂等發現細胞核內的lncrna

22、-malat1能影響絲氨酸，精氨酸富含性剪接因子在細胞核的分布而調節基因的選擇性剪接。精品.lncrna在翻譯后水平也有調節作用。它可以折疊成高級結構與特定的蛋白質結合形成核酸- 蛋白質復合物，paraspeckle 是哺乳動物細胞核中分散的核質蛋白體，lncrna-men/是paraspeckle的組成成分，lncrna-men /和相關paraspeckle蛋白質結合后能改變paraspeckle在細胞核內的定位，從而在細胞核組裝和解聚過程中起重要作用5。5.3 參與癌癥的調控值得注意的是，長非編碼rna與癌癥等有著密切的關系，對癌癥的發生、發展及轉移產生重要的影響。有一些長非編碼rna，

23、比如pca3、pcgem1、pcat1 等，是高度在前列腺癌中特異表達的非編碼rna，可以作為有效的生物標記物。有多種長非編碼rna 在原發性肝癌中表達水平發生了顯著變化，并具有重要作用2。圖：陳曉敏等，長非編碼rna研究進展其中，hotair在原發性和轉移性乳腺癌中高表達，且與腫瘤轉移和低生存率相關，研究發現hotair的5 端可結合prc2，而其3 端可結合lsd1。hotair的雙向功能可能有利于對組蛋白進行修飾，從而促進腫瘤的轉移4。ink4b-arfink4a的表達產物參與構成腫瘤抑制網絡，調控細胞重要生物學過程，如細胞凋亡、干細胞再生等。anril的異常表達和單核苷酸變異可引起腫瘤

24、。此外，lncrna和mirna可協同介導抑癌基因失調4。5.4 參與糖代謝的調節6精品.5.4.1 lncrna通過調控癌基因表達影響腫瘤細胞的糖代謝。癌基因c-myc的是myc蛋白家族的重要成員之一，在細胞周期，血管生成，細胞代謝和細胞凋亡中發揮著重要作用。研究發現，c-myc可以直接調控參與糖代謝的基因，而前列腺癌特異性lncrna-前列腺癌基因表達標志1（pcgem1）通過激活c-myc促進前列腺癌細胞有氧糖酵解的糖攝取。5.4.2 lncrna受胰島素/胰島素樣生長因子調控而影響腫瘤細胞的糖代謝。糖代謝與胰島素信號通路密切相關，所以調控該通路的lncrna也可間接調控糖代謝，而胰島素信號通路也可反過來調控lncrna。lncrna大腸癌差異表達轉錄本（crnde）受胰島素/胰島素樣生長因子（igf）調控。研究發現，人大腸癌ht29細胞的crnde表達受胰島