生命科學進展,羅曉霞,1,中心法則,生命現象的研究逐漸由獲取基因序列信息轉向研究基因功能，基因功能的具體體現者就是蛋白質。,前言：,2,蛋白質相互作用,蛋白質可以通過某種方式與蛋白質，核酸或其他分子之間發生相互作用而形成一定形態的蛋白復合物。,多亞基蛋白復合體,酶-底物,抗原-抗體,3,研究蛋白質相互作用的重要意義,絕大多數疾病都是由特定蛋白質相互作用所致。對200種蛋白質及2000種組合結構進行解析后，發現其中三分之一的蛋白質相互組合會導致疾病；容易導致疾病的蛋白質和其它蛋白質結合以后也將變得十分活躍，致使發病和病情惡化。,蛋白質相互作用和識別在諸如DNA的復制與轉錄、蛋白質的合成與分泌，生物催化、物質轉運、新陳代謝、信號傳導、免疫、細胞調控等多種重要的生命過程起著重要的作用。,蛋白質之間相互作用以及通過相互作用而形成的蛋白復合物是細胞各種基本功能的主要完成者。,4,每一種蛋白質不是孤立存在于細胞中，而是與其它蛋白質或核酸或其他小分子一起進行相互作用來行使其功能，從而使得細胞中所有蛋白質形成一個相互作用的網絡，同時功能相同和相似的蛋白質在一起組成相關的功能模塊，以完成相關的生理功能。,蛋白質相互作用網絡,5,蛋白質相互作用的檢測和分析方法,一，酵母雙雜交系統，YeastTwo-HybridSystem；,二，噬菌體表面展示技術，PhageDisplay；,1.谷胱苷肽-S-轉移酶沉淀，GST-pulldown；,三，基于親和層析的蛋白質相互作用研究平臺,2.免疫共沉淀，Co-immunoprecipitation；,3.親和印跡，Ligandblot。,6,一，酵母雙雜交系統YeastTwo-HybridSystem,1989年Field和Song等人在酵母細胞中設計的分析蛋白質相互作用的方法，以真核細胞轉錄激活因子的結構和活性特點為基礎的。,Stelzl等(2005)和Raul等(2005)則先后分析了人腦組織、人已知ORF中大規模的蛋白質相互作用網絡。,Rain等(2001)用該法繪制了人類胃腸道病原菌Helicobacterpylori的大規模蛋白質相互作用圖譜。,隨后，Giot等(2003)和Li等(2004)在果蠅和線蟲中也成功地研究了大規模的蛋白質相互作用。,7,酵母激活因子GAL4：N端：147個氨基酸組成的DNA結合域(DNAbindingdomain,BD)，C端：113個氨基酸組成的轉錄激活域(transcriptionactivationdomain,AD)。GAL4分子的DNA結合域可以和上游激活序列(upstreamactivatingsequence，UAS)結合，而轉錄激活域則能激活UAS下游的基因進行轉錄。組成部分：（1）與BD融合的蛋白表達載體，被表達的蛋白稱誘餌蛋白（bait）；（2）與AD融合的蛋白表達載體，被其表達的蛋白稱靶蛋白（prey）；（3）帶由一個或多個報告基因的宿主菌株。,酵母雙雜交系統工作原理,8,酵母雙雜交實驗流程,9,酵母雙雜交系統的應用范圍,檢測已知蛋白質之間的相互作用；確定蛋白質相互作用功能區域位點；篩選與靶蛋白發生相互作用的未知蛋白。,10,不需分離和標記靶蛋白，采用高拷貝和強啟動子的表達載體使雜合蛋白過量表達，避免蛋白質純化過程；檢測在活細胞內進行，真實反應體內蛋白質間相互作用情況；敏感度高，可檢測存在于蛋白質之間的微弱的或暫時的相互作用；可進行高通量篩選；成本低，無需特殊的檢測設備。基因型和表型相聯系，可直接得到相互作用蛋白的編碼序列。,酵母雙雜交系統的優點,11,限于檢測定位于細胞核內的蛋白質間相互作用；假陽性：本身具有激活轉錄功能的蛋白；cDNA反向插入；融合蛋白可能會影響蛋白的真實結構和功能。蛋白質與蛋白質,酵母雙雜交系統的局限性,12,二，噬菌體表面展示技術PhageDisplay,噬菌體：感染細菌、真菌、放線菌或螺旋體等微生物的病毒。,13,1985年Smith證實噬菌體fd基因組能通過基因工程的手段進行改造。1988年Parmley將已知抗原決定簇與噬菌體PN端融合呈現在其表面。1990年McCafferty用噬菌體展示技術篩選溶菌酶的單鏈抗體成功使噬菌體展示技術進入一個廣泛應用的時代。一系列噬菌體文庫的構建噬菌體展示技術煥發出了新的生命力。,噬菌體展示技術的發展簡史,14,利用固相支持物上的抗體或受體，采用親和篩選法從噬菌體文庫中篩選出能結合篩選分子的目的噬菌體。,在噬菌體pIII和p衣殼蛋白N端插入外源待篩基因編碼的蛋白或cDNA文庫，形成的融合蛋白表達在噬菌體顆粒的表面；,外源多肽或蛋白質表達在噬菌體的表面，其編碼基因可通過分泌型噬菌體的單鏈DNA測序推導出來。,噬菌體表面展示技術原理,15,噬菌體表面展示操作流程,構建cDNA文庫，使外源基因與外殼蛋白基因融合，導入噬菌體,Display,Bindtoantigen,Washtoremoveunboundphage,Elute,Amplify,Analyze,Detect,Elisa,噬菌體展示技術一般要經過多輪的篩選，這樣就可以得到在文庫中含量很低的與配基特異作用的蛋白質。,16,大規模篩選與特異抗體或受體相互作用的未知蛋白質；研究抗體或受體與抗原或底物的結合位點；可用于構建隨機多肽庫、抗體庫和蛋白文庫；研究新型多肽藥物、疫苗和抗體；可研究蛋白質與核酸相互作用的生物學過程；非蛋白小分子與蛋白相互作用的研究；酶作用底物的分析。,噬菌體表面展示應用范圍,17,應用范圍非常廣；可用于高通量篩選；可研究含量很低的與配體特異作用的蛋白質；可直接得到相互作用蛋白的編碼序列。,噬菌體表面展示優點,需要標記的抗體或配體來檢測結合情況；外源蛋白大小受到限制，不能研究大分子量蛋白質的相互作用；原核表達體系中外源蛋白質無法正確折疊或修飾；融合蛋白可能會影響到蛋白質本身的結構或生物活性。,噬菌體表面展示缺點,18,1.谷胱苷肽-S-轉移酶沉淀試驗(GST-pulldown),三、基于親和層析的蛋白質相互作用研究平臺,2.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation),3.Ligandblot,基本原理是將一種蛋白質或抗體固定于某種基質上（如Sepharose，NC膜或PVDF膜等），當細胞抽提液經過改基質時，可與該固定蛋白相互作用的配體蛋白被吸附，而沒有吸附的非目標蛋白則隨洗脫液流出。被吸附的蛋白可以通過改變洗脫液或者洗脫條件而回收下來，然后對其進行分析鑒定。,19,1.谷胱苷肽-S-轉移酶沉淀試驗(GST-pulldown),1988年smith等利用谷胱甘肽S轉移酶融合標簽從細菌中一步純化出GST融合蛋白，從此GST融合蛋白在蛋白質相互作用研究領域里得到了極大的推廣。,GST-pulldown方法是將誘餌蛋白質和GST標簽融合表達。一步純化后與含有目的蛋白質的溶液培育，之后利用谷胱甘肽瓊脂糖球珠將融合蛋白:目的蛋白復合物沉淀下來，然后進行聚丙烯酰胺凝膠電泳或質譜鑒定與誘餌蛋白質相互作用的蛋白質。,20,GST,X,谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,細胞裂解物,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,GST,X,GST,X,Y,GST-pulldown篩選未知的結合蛋白,設置GST對照，排除GST的影響,Y,Y,Y,Y,Bind,Washtoremoveunboundprotein,Elute,Analyze,Bind,21,GST-pulldown驗證兩個已知蛋白的相互作用,GST,X,谷胱甘肽-瓊脂糖球珠,純化的Y蛋白,4下孵育2h,GST融合蛋白,GST,X,GST,X,GST,+,+,GST,純化的Y蛋白,GST,Y,Y,Y,Bind,Washtoremoveunboundprotein,Detect,Bind,Bind,22,不需要制備抗體來檢測結合情況；不需要對誘餌蛋白進行標記，避免了使用同位素等危險物質；,GST-pulldown的優點,GST-pulldown的缺點,2.假陽性。蛋白質所帶電荷引起的，并不是生理性的相互作用；有時會檢測到兩種在細胞中不可能相遇卻有極強親和力的蛋白。,該方法只適用于確定體外的相互作用；,3.融合蛋白可能會影響蛋白的真實結構和功能。,23,原理：當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質蛋白質間的相互作用被保留了下來。如果用蛋白質X的抗體免疫沉淀X，那么與X在體內結合的蛋白質Y也能沉淀下來。之后純化靶蛋白免疫復合物，凝膠電泳分離后，質譜鑒定靶蛋白的結合蛋白。,2.免疫共沉淀(Co-immunoprecipitation),24,Binding,wash,elution,細胞裂解物,Detection,免疫共沉淀技術流程,25,檢測是在生理條件下進行，可以真實地體現在生命過程中蛋白質之間的相互作用；可進行大規模的篩選；可檢測依賴于修飾的蛋白質之間的相互作用;可以分離得到天然狀態的相互作用蛋白復合物。,免疫共沉淀技術的優點,免疫共沉淀技術的缺點,靈敏性不高。不能檢測和分析低表達量的蛋白之間的相互作用；假陽性。受免疫球蛋白的干擾容易產生假陽性；需要制備高質量抗體。以終產物為檢測對象，檢測不到瞬間有相互作用的蛋白質；,26,3.親和印記，Ligandblot,將PAGE膠上分離好的蛋白樣品轉移到硝酸纖維膜上，然后檢測哪種蛋白能與標記的誘餌蛋白發生作用，最后通過顯影或顯色反應信號確定相互作用蛋白，最后通過質譜對其進行鑒定。,27,誘餌蛋白的標記技術,PNAS,2007,JBC,2005,FEBSJ,2008,樣品蛋白的分離和固定技術,Ligandblot的應用,BBRC,2007,28,1.轉膜前需要將蛋白質復性，不能完全恢復到天然狀態；,Ligandblot技術的缺點,2.需要對蛋白進行標記或要制備抗體；,2.靈敏度不高，很難鑒定分離低表達量的相互作用蛋白；,2.實驗在體外進行，很難鑒定修飾的蛋白或蛋白復合體。,Ligandblot技術的優點,1.操作簡便，尤其是對于在變性條件下也能發生相互作用的蛋白的鑒定和驗證；,2.可鑒定靶蛋白與受體的結合位點。,29,Outline,RegulatoryRNAsinBacteriaDiscoveryofsRNATargetofsRNAPredictionsRNAinBacilluscereusgroup,30,RegulatoryRNAsinBacteria,RiboswitchesCRISPRsRNAs(smallRNAs),31,Riboswitches,位于所調節的mRNA的5端與所調節的mRNA一起轉錄通過改變RNA的結構來影響轉錄或翻譯由兩部分組成：aptamerregion，結合配體；expressionplatform，改變RNA結構能感應氨基酸，核苷酸，金屬離子等小分子，也能感應細胞組分（如特殊的tRNA），還能感應溫度等環境因素,32,Riboswitches的響應配體的作用方式,通過改變mRNA的結構影響轉錄或翻譯,WatersandStorz,Cell,2009,33,Riboswitches響應溫度的作用方式,低溫時，SD序列與ASD序列配對形成莖環結構，當溫度升高時，莖環結構解開，露出SD序列,Henkin,GenesDev.,2008,34,CRISPR結構與功能,CASgene:CRISPR-associatedgene功能多數未知，但往往具有DNA或RNA結合domain，解螺旋酶Domain，內切酶或者外切酶domainLeadersequence：大概550bp左右RepeatedDNA：24-47bp，重復2-249次Spacer：26-72bp,WatersandStorz,Cell,2009,35,CRISPR介導的phage抗性,Soreketal.,Nat.Rev.Microbiol.,2008,36,sRNA,sRNAsthatModulateProteinActivityCis-encodedbasepairingsRNATrans-encodedbasepairingsRNAExtendofsRNA,37,sRNAsthatModulateProteinActivity,大腸桿菌中作用的例子,WatersandStorz,Cell,2009,38,Cis-encodedbasepairingsRNA,具有獨立的啟動子和轉錄終止子，沒有ORF一般由目標mRNA的互補鏈編碼，直接位于ORF的互補鏈或者operon的中間與目標mRNA某區域完全配對目前大部分來源于噬菌體，質粒，轉座子；在質粒中，調節復制，分離等；在轉座子中調節轉座頻率；在噬菌體中，調節溶原與溶解,Brantl,FutureMicrobiol.,2009,39,ActionmenchanismofCis-encodedbasepairingsRNA,直接結合到RBS區或者mRNA中間，引起mRNA降解或者翻譯終止,WatersandStorz,Cell,2009,40,Trans-EncodedBasePairingsRNAs,往往位于基因之間的間隔區，有獨立的啟動子和轉錄終止位點長度一般50到600bp，主要是50到200nt之間與目標基因相隔較遠與目