細菌總數(shù)的測定（1）培養(yǎng)計數(shù)法一、目的1.掌握從微生物群體中土壤和飼料等）獲得純種微生物的分離和培養(yǎng)技術(shù)。2.掌握無菌操作技術(shù)。二、材料和器皿1. 天平、取樣工具、涂布棒(接種棒)。 2. 無菌三角瓶、試管、培養(yǎng)皿、移液管、玻璃珠。 3. 無菌水。 4. 培養(yǎng)基：牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基。三、實驗操作步驟1、取樣 將待測樣品充分混勻，取少量，備用。2、 倒平板 熔化已滅菌的上述4種培養(yǎng)基并冷卻至45oC左右倒平板，凝固待用，每種培養(yǎng)基每個稀釋度各三只平板。3、編號 取5支無菌空試管（15150mm）依次編號為10-3、10-4、10-5、10-6、10-7。4、分裝無菌水 按無菌操作用5mL移液管分別吸取4.5mL無菌水于編號的各無菌空試管中。5. 制備土壤稀釋液 稱土樣1g于盛有99mL無菌水或無菌生理鹽水并裝有玻璃珠的三角瓶中，振蕩1020min，使土樣中的菌體、芽孢或孢子均勻分散，此即為10-2濃度的菌懸液。用無菌移液管吸取懸液0.5mL于4.5mL無菌水試管中，用移液管吹吸三次、搖勻，此即為10-3濃度。同樣方法，依次稀釋到10-7。稀釋過程需在無菌室或無菌操作條件下進行。環(huán)境要求：瓊脂平板在工作臺暴露15分鐘，每個平板不得超過15個菌落。代表性：取固體樣品時需多采幾個部位，且經(jīng)過均質(zhì)或研磨；液體樣品須經(jīng)過振搖，以獲得均勻稀釋液。 減少誤差：每遞增稀釋一次即換用1支1ml滅菌吸管，將吸管內(nèi)液體沿管壁流入， 勿使吸管尖端伸入稀釋液內(nèi)，并且稀釋液應(yīng)充分振搖。6、 培養(yǎng)及計數(shù)計數(shù)時間：到達規(guī)定培養(yǎng)時間，應(yīng)立即計數(shù)。如果不能立即計數(shù)，應(yīng)將平板放置于04，但不得超過24h。計平皿中菌落數(shù)：肉眼觀察，必要時用放大鏡檢查。記下各平板的菌落總數(shù)，求出同稀 釋度的各平板平均菌落數(shù)。規(guī)律：不同稀釋度的菌落數(shù)應(yīng)與稀釋倍數(shù)成反比（同一稀釋度的二個平板的菌落數(shù)應(yīng)基本接近），即稀釋倍數(shù)愈高菌落數(shù)愈少，稀釋倍數(shù)愈低菌落數(shù)愈多。如出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，則應(yīng)視為檢驗中的差錯（有的食品有時可能出現(xiàn)逆反現(xiàn)象，如酸性飲料等），不應(yīng)作為檢樣計數(shù)報告的依據(jù)。當平板上有鏈狀菌落生長時，如呈鏈狀生長的菌落之間無任何明顯界限，則應(yīng)作為一個菌落計，如存在有幾條不同來源的鏈，則每條鏈均應(yīng)按一個菌落計算，不要把鏈上生長的每一個菌落分開計數(shù)。如有片狀菌落生長，該平板一般不宜采用，如片狀菌落不到平板一半，而另一半又分布均勻，則可以半個平板的菌落數(shù)乘2代表全平板的菌落數(shù)；當計數(shù)平板內(nèi)的菌落數(shù)過多（即所有稀釋度均大于300時），但分布很均勻，可取平板的一半或1/4計數(shù)。再乘以相應(yīng)稀釋倍數(shù)作為該平板的菌落數(shù)。計數(shù)原則：選平均菌落數(shù)在30300之間者進行計算1.僅1個稀釋度的平均菌落數(shù)在此范圍時，則以該平均菌落數(shù)乘其稀釋倍數(shù)報 告之。2.若有2個稀釋度的平均菌落數(shù)在30300之間時，則按兩者的菌落總數(shù)之比來決 定，若比值小于2應(yīng)報告兩者的平均數(shù)；若大于2則報告其中較小的菌落總數(shù)。3.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均大于300，以稀釋度最高的平均菌落數(shù)乘以稀釋倍 數(shù)報告之。4.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均小于30，則應(yīng)按稀釋度最低的平均菌落數(shù)乘以稀 釋倍數(shù)報告之。5.若所有稀釋度的平均菌落數(shù)均不在30300之間，則以最接近300或30的平均菌 落數(shù)乘以稀釋倍數(shù)報告之。6. 若所有的菌落數(shù)勻為“無法計數(shù)”時，應(yīng)注明水樣的最大稀釋倍數(shù)。7在求同稀釋度的平均數(shù)時，若其中1個平板上有較大片狀菌落生長時，則不宜采用，而應(yīng)以無片狀菌落生長的平板作為該稀釋度的平均菌落數(shù)。若片狀菌落約為平板的一半，而另一半平板上菌落分布很均勻，則可按半平板上的菌落計數(shù)，然后乘以2作為整個平板的菌落數(shù)。7、 菌落總數(shù)報告方式菌落數(shù)的報告，按國家標準方法規(guī)定菌落數(shù)在1100時，按實有數(shù)字報告，如大于100時，則報告前面兩位有效數(shù)字，第三位數(shù)按四舍五入計算。為了縮短數(shù)字后面的零位，可用10的指數(shù)來表示。固體檢樣以克（g)為單位報告，液體檢樣以毫升（mL）為單位報告，表面涂擦則以平方厘米（cm2）報告。8. 計數(shù) 選菌落分散、菌落數(shù)適量且各平行皿菌落數(shù)接近的稀釋度的平皿計數(shù)，通常細菌和放線菌選取菌落數(shù)在30300之間的平皿，霉菌選菌落數(shù)在10100之間的平皿，最后換算成每克待測干樣品所含菌數(shù)。 同一稀釋度的平均菌落數(shù)稀釋倍數(shù)每克樣品含菌數(shù) = 1樣品含水量(2) 直接鏡檢法一、目的要求1、明確血球計數(shù)板計數(shù)的原理2、掌握測定細胞總數(shù)、活菌數(shù)百分率的技術(shù)二、實驗原理鏡檢計數(shù)法適用于各種含單細胞菌體的純培養(yǎng)懸浮液，如有雜菌或雜質(zhì)常不易分辨。菌體較大的酵母菌或霉菌泡子可采用血球計數(shù)板；一般細菌則采用彼得羅夫霍澤(Petroff Hausser)細菌計數(shù)板。兩種計數(shù)板的原理和部件相同，只是細菌計數(shù)板較薄，可以使用油鏡觀察。而血球計數(shù)板較厚，不能使用油鏡，故細菌不易看清。血球計數(shù)板是一塊特制的厚載玻片，載玻片上有4條槽而構(gòu)成3個平臺。中間的平臺較寬，其中間又被一短橫槽分隔成兩半，每個半邊上面各有一個方格網(wǎng)。每個方格網(wǎng)共分9大格，其中間的一大格(又稱為計數(shù)室)常被用作微生物的計數(shù)。計數(shù)室的刻度有兩種：一種是大方格分為16個中方格，而每個中方格又分成25個小方格；另一種是一個大方格分成25個中方格，而每個中方格又分成16個小方格。但是不管計數(shù)室是哪一種構(gòu)造，它們都有一個共同特點，即每個大方格都由400個小方格組成。每個大方格邊長為1mm，則每一大方格的面積為1mm2，每個小方格的面積為1400mm2，蓋上蓋玻片后，蓋玻片與計數(shù)室底部之間的高度為0.1mm，所以每個計數(shù)室(大方格)的體積為0.1mm3，每個小方格的體積為l4000mm3。使用血球計數(shù)板直接計數(shù)時，先要測定每個小方格(或中方格)中微生物的數(shù)量，再換算成每毫升菌液(或每克樣品)中微生物細胞的數(shù)量。 血球計數(shù)扳的構(gòu)造血球計數(shù)板計數(shù)網(wǎng)的分區(qū)和分格三、實驗器材待測菌懸液，顯微鏡，血球計數(shù)板，載玻片，電吹風(fēng)，蓋玻片，接種環(huán)，0.1%呂氏美藍染色液。四、方法步驟1、菌懸液的制備為便于計數(shù)，對樣品進行適當稀釋，稀釋程度以每小格內(nèi)含5-10個為宜，可采用10倍系列稀釋法。對于固體待測物，取10g放入盛有90ml無菌水的三角瓶中，充分震蕩20分鐘，使待測物與水充分混合，此為待測物10-1懸液，吸取1ml此懸液，置于9ml無菌水中，另用無菌吸管吹吸3次混勻，此為10-2懸液，以此類推。2、鏡檢計數(shù)室在加樣前，先對計數(shù)板的計數(shù)室進行鏡檢。如有污物，則需清洗，用點吹風(fēng)吹干后才能進行計數(shù)。3、加樣品將清潔干燥的血球計數(shù)板蓋上蓋玻片，再用無菌的毛細滴管將搖勻的菌懸液由蓋玻片邊緣讓菌液沿縫隙靠毛細滲透作用自動進入計數(shù)室，用吸水紙吸去多余菌液。樣品要均勻充滿計數(shù)室，不可有氣泡。4、顯微鏡計數(shù)加樣后靜止5min，然后將血球計數(shù)板置于顯微鏡載物臺上，先用低倍物鏡尋找計數(shù)室的位置，然后換成高倍物鏡（40倍）進行計數(shù)。顯微鏡視野中的光線要暗一些，否則，不容易看清計數(shù)室的方格線。計數(shù)時，對位于線上的細菌，可采取只計數(shù)兩條邊的辦法，即遵循查上不查下，查左不查右的原則。當芽體達到母細胞大小1/2時，即可計作兩個細胞。細胞數(shù)（mL）=80小格內(nèi)酵母菌細胞數(shù)/8040010000稀釋倍數(shù)=4na106式中 n稀釋倍數(shù) A平均每個中格細胞數(shù)5、活菌數(shù)的測定 滴一滴0.1%呂氏美藍液于載玻片中央，再用接種環(huán)取菌液