分析化學(FE NXI H UAX UE 評述與進展第9期2002年9月Chinese Journal of Analytical Chemistry 11301136第30卷評述與進展半導體納米晶體的光致發光特性及在生物材料熒光標記中的應用孫寶全徐詠藍衣光舜陳德樸1121312(清華大學化學系, 北京100084 (石油大學化工學院環境中心, 北京102200摘要介紹了半導體納米晶體(亦稱量子點 的結構特征和光致發光特點, 并與有機熒光染料分子的光致發光性質作了對比。結合本實驗室所做的工作, 對半導體納米晶體用于生物材料的連接、。關鍵詞半導體納米晶體, 熒光, 生物材料, 標記, 評述1引言, 尤其是在光學和生1物學方面, 。國際上許多高水平的期刊如Science 和Nature 、物理化學特征和其在生物醫學和光電子領。, 并計劃于T M 92001QDOT 產品。82半導體納米晶體的結構和特征半導體納米晶體是由數目極少的原子或分子組成的原子或原子團簇。目前文獻中報道的主要涉及的是主族如CdSe 、如InP 、InAs 和G aAs 副族化合物以及Si 等元素, 特別是和副族化合物尤其引起人們的關注。由于光譜禁阻的影響, 當這些半導體納米晶體的直徑小于其玻爾直10徑(一般小于10nm 時, 這些小的半導體納米晶體就會表現出特殊的物理和化學性質, 如Si 納米晶體1112和多孔Si 可發光, 晶體的大小會影響晶體的晶相結構和熔點。半導體納米晶體的結構導致了它具有尺寸量子效應和介電限域效應并由此派生出半導體納米晶體獨特的發光特性。半導體的光致發光原理如圖1所示。當一束光照射到半導體上時, 半導體吸收光子后價帶上的電子躍遷到導帶, 導帶上的電子可以再躍遷回到價帶, 放出光子; 也可以落入半導體中的電子陷阱。當電子落入較深的電子陷阱后, 絕大部分以非輻射的形式而淬滅了, 只有極少數的電子以光子的形式躍遷回價帶或非輻射的形式回到導帶。所以, 當半導體中的電子陷阱較深時, 量子產率就會較低。2. 1尺寸量子效應半導體納米晶體是尺寸小于100nm 的超微粒。在納米尺度范圍內, 半導體納米晶體隨著其粒徑的減小, 會呈現量子化效應, 顯示出與塊體不同的光學和電學性質。塊狀半導體的能級為連續的能級, 如圖1所示。當顆粒減小時, 半導體的載流子被限制在一個小尺寸的勢阱中, 在此條件下, 導帶和價帶過渡為分立的能級(圖1 , 因而使得半導體有效能級差增大, 吸收光譜閾值向短波方向移動, 這種效應就稱為尺寸量子效應。任何一種材料, 都存在一個臨界晶體大小限制, 小于該尺寸的晶體的光學和電學性質產生巨大變化。與金屬導體、絕緣體和范德華晶體相比, 半導體納米晶體帶寬較大, 受量子尺寸效應13,14的影響非常明顯, 當顆粒在納米級時顯示出特殊的光學特征。2001208222收稿;2002202211接受本文系國家自然科學基金資助課題(N o. 39989001 第9期孫寶全等:半導體納米晶體的光致發光特性及在生物材料熒光標記中的應用1131圖1Fig. 1Energy transition diagrams of bulk 圖中實線表示輻射躍遷, all in s olid lines , and all non 2radioactive ones are 。2. 2, 顆粒表面的原子數目與處于粒子內部的原子數目的比值增加, 。與塊狀半導體相比, 在半導體顆粒的表面存在更多電子陷阱, 電子陷阱對半導體的光致發光特性起著關鍵的作用。半導體超微粒表面上修飾某種介電常數較小的材料后, 它們的光學性質與裸露的超微粒相比, 發生了較大變化, 此種效應稱為介電限域效應。當介電限域效應所引起的能量變化大于由于尺寸量子效應所引起的變化時, 超微粒的能級差將減小, 反映到吸收15光譜上就表現為明顯的紅移現象。半導體納米晶體的表面一般連接有長鏈的烷基氧化膦(如T OPO 或烷基膦(如T OP , 介電常數小, 使得吸收光譜向長波長移動。將半導體納米晶體的表面包上一層能級差更大的殼層, 由于介電限域效應也會使得吸收光譜紅移。3半導體納米晶體的發光特性由于尺寸量子效應和介電限域效應的影響, 使得半導體納米晶體顯示出獨特的熒光特性。半導體納米晶體的發光特性具有以下特點:半導體納米晶體的激發波長的范圍較寬, 發射波長的范圍較窄, 斯托克斯位移大。半導體納米晶體具有很高的量子產率, 核殼結構(如在CdSe 納米顆粒表面在包上一層16InP 層 的半導體納米晶體的量子產率一般都在30%以上,Peng 等人報道了CdSe CdS 納米晶體室溫下的量子產率可以達到100%。同一種組分的納米材料, 納米晶體的粒徑不同時, 可以發出不同光(如圖2 。用同一波長的光照射不同直徑的ZnS CdSe 納米晶體即可獲得從藍色到紅色幾乎所有可見波長的光1817。在有機熒光標記試劑中, 很難得到發射波長達800nm 以上的化合物, 納米晶體InP 、InAs 可以獲得7001500nm 多種發射波長的材料, 可填補普通熒光分子在近紅外光譜范圍內品種少的不19,20足。半導體納米晶體的發光壽命可達ms 級, 并且不易被光漂白。5,21半導體納米晶體的形狀除球形外, 還有箭頭狀、淚滴狀、棒狀等多種形狀。Peng 等首次報道了族半導體納米棒CdSe , 與球形半導體納米晶體相比, 前者的斯托克斯位移比后者大得多, 同時, 在聚乙烯2丁烯上整齊排列的納米棒在沿長軸方向上出現極化發射現象, 這將對納米棒用于生物材料標記時確定標記材料的取向很有幫助。本實驗室合成了ZnS CdSe 半導體納米顆粒, 其熒光光譜如圖3所示。通過將CdSe 納米晶體的表面包覆一層帶隙更大的ZnS , 使其熒光量子產率大幅度提高, 可達到50%, 光學穩定性增加, 與CdSe 的光譜相比, 包覆ZnS 的納米粒子的光譜發生紅移。我們通過改變不同的晶體大小, 得到了不同發射波長的1132分析化學22第30卷半導體納米顆粒。4半導體納米晶體在生物材料熒光標記中的應用生物材料的標記技術是影響臨床檢測靈敏度的關鍵技術。目前, 用于生物材料標記的主要是有機熒光染料。如對基因芯片和蛋白芯片的生物材料T M T M 進行熒光標記的物質主要是花菁染料如Cy3,Cy5等。這類熒光材料與大多數有機熒光染料料一樣,量子產率較低, 對檢測系統光學部分要求比較嚴格。較窄的激發波長范圍對選擇激發光源要求苛刻, 發射波長范圍較寬且常在長波長區域拖尾會在不同的檢測通道之間帶來光譜的相互干擾; 激發波長和發射波長較大程度的重疊, 在檢測發射光時會受激發光的影響, 給檢測帶來了困難。4. 12423圖con finement effect , 定, 、pH 、溫度等的影響, 可使, 如對其表面進行親水化處理后可均勻分散于水中。使用與有機熒光分子類似方法可以特異性地用于標記生物材料如細胞、蛋白質和核酸, 并具有更好的熒光特性, 參見表1。半導體納米晶體的發光壽命比普通熒光標記染料的壽命長12個數量級, 可采取時間分辨技術來檢測信號, 這樣可大幅度降低背景的強度, 獲得較高的信噪比。半導體納米晶體在生物材料熒光標記領域中的主要優點是可以使用同一激發光源同時進行多通道25的檢測。例如, 細胞學家根據細胞結合不同的抗體對細胞進行分類, 分子生物學家需要同時對成千圖3兩種不同直徑的半導體納米晶體ZnS CdSe 的熒光光譜圖上萬個DNA 寡核苷酸進行檢測, 臨床診斷需要對不Fig. 3The fluorescence spectra of tw o kinds of 同的抗體或抗原同時進行檢測, 單通道的熒光標記semiconductor nanocrystals with different sizesa. 2. 7nm , b. 4. 4nm 。探針只能對同一樣品進行反復多次檢測, 費時、費力、費試劑, 有時候甚至是不可能的。雖然可找到具有不同發射波長的有機熒光探針分子, 但同時具有相同激發波長和不同發射波長的有機熒光探針卻不多。每種染料分子都需要自己相應的激發光源。半a 表1半導體納米晶體(ZnS CdSe 與熒光染料(FIT C , R6G 的熒光特性的比較T able 1C omparis on of fluorescence spectral properties of semiconductor nanocrystals (ZnS CdSe and C omm only Used Fluorescent Dye (熒光物質Fluorophores b 量子產率QY b 半高度寬FWH M , nm b 吸收波長b A , nm 發射波長E b , nm 光漂白時間t 12, s 摩爾吸光系數M ole abs orption coefficient , L m ol -1cm -1半導體納米晶體(S N b 0. 50. 8512300620480630960108ZnS CdSep0. 30. 8549251652572000異硫氰基熒光素(FITC b 3552555510羅丹明6G (R6G b a. 引自文獻2,3,24(from references 2,3,24 ; b. S N :semiconductor nanocrystals ; FITC :fluoresein 252is othiocyanate ; R6G:rhodamine 6G; QY:quantum yield ; FWH M:full width at half maximum ; A :absorption wavelength ; E :emission wavelength ; t 12:time constant against photobleaching第9期孫寶全等:半導體納米晶體的光致發光特性及在生物材料熒光標記中的應用1133導體納米晶體組成和粒徑大小不同時可發出不同波長的光, 發射光譜峰半寬比普通熒光染料窄, 且峰形對稱, 這樣, 在一個可檢測到的光譜范圍內可同時使用多個探針。兩種核2殼結構的半導體納米晶體, 一種發出綠色熒光, 另一種發出紅色熒光, 用于生物材料標記后用一個激發光源成功進行雙通道檢測, 更26多的有關多通道檢測的工作正在進行中。半導體納米晶體的發射光譜覆蓋從紫外到紅外區域, 而很少熒光染料的發射波長能在800nm 以上。對于一些不利于在紫外或可見區域進行檢測的生物材料, 可利用半導體納米晶體標記在紅外區域進行檢測, 完全避免紫外光對生物材料的傷害, 特別有利于活體生物材料的檢測, 同時, 將大幅度降低熒光背景對檢測信號的干擾。用發光半導體納米晶體補充或部分取代有機熒光標記材料, 將開創超靈敏度、高穩定性以及長發光壽命的生物檢測技術。近年來, 有報道可大量制備大小分布較為均勻的半導體納米晶體的方法。另外, 納米晶體性能穩定, 易于儲存和運輸, 很適合商品化。4. 2半導體納米晶體與生物材料的標記方法27, 為了能與DNA 或蛋白質等生物材料相連, 材料相連。其一, 、, 使半導體納米晶體與巰基3酸絡合帶上羧基, 、二巰基辛酸等, 如圖4所示。Nie 等利用, 使半導體納米晶體帶上羧28, 同時, 羧基可以與帶有胺基的生物分子進行連接。Mitchell 等, 再與42(二甲基氨基 2吡啶絡合, 半導體納米晶體的親水性大幅度增加。亦可以用含多個巰基的分子對半導體納米晶體的表面進行修飾。如用6,82二巰基辛酸對ZnS CdSe 表面進行處理時, 由于含有兩個巰基, 可使6,82二巰基辛酸與半導體納米晶體表面的結合作用更強, 同時6,82二巰基辛酸的分子較長, 為半導體納米晶體與生物材料的連接提供了較長的連接29臂, 使二者偶聯更容易, 且不破壞標記生物材料的活性。亦可以用含多個羧基的分子對半導體納米晶體的表面進行修飾。如本實驗室采用巰基丁二酸修飾半導體納米晶體, 由于巰基丁二酸含有兩個羧基, 具有更強的親水性, 使的表面修飾后的半導體納米晶體可完全溶于水30。圖4半導體納米晶體與生物分子連接的示意圖Fig. 4Scheme of semiconductor nanocrytals conjugating with the biological m olecular在圖中, 半導體納米晶體是核(CdSe 殼(ZnS 結構, 表面吸附三正辛基膦(PO (Oct 3 (in the figure , thesemiconductor nanocrystal is the core shell structure whose surface abs orbs trioctanal phosphine 。NH 22R :生物分子(biological m olecale , 其中R 可以是細胞(in which R may be cell 、生物素(biotin 、親和素(avidin 、免疫球蛋白(IgG 、DNA 和RNA 等生物分子(etc. 。E DC :12ethyl 2332dimethylaminopropyl carbodiimide hydrochloride ,NHS (N 2hydroxysuccinimide :它們都是胺基和羧基反應形成酰胺的優良的縮合劑(they are all the g oodcatalyzers of the condensation reactions between amino and carboxyl for the formation of amides 。其二, 將半導體納米晶體的表面包覆一層親水層的無機物, 然后在表面修飾可與生物材料連接的官11342分析化學第30卷能團。Alivisatos 等將半導體納米晶體的表面包上一層SiO 2后并用堿處理使半導體納米晶體的表面帶上羥基, 使半導體納米晶體具有較好的水溶性; 然后用硅烷化試劑32氨基丙基三乙氧基硅烷處理半導體納米晶體, 使其表面連接上氨基后再與生物素連接。利用生物素與鏈親和素之間的特異性相互作用, 生物素標記的半導體納米晶體特異性連接到鏈親和素標記的鼠3T3肌動細絲蛋白上。對半導體納米晶體表面不包覆直接進行修飾, 方法相對比較簡單, 容易操作。而對半導體納米晶體表面包覆一層物質, 發光強度往往會下降, 并且操作的難度較大。4. 3半導體納米晶體標記蛋白質利用表面修飾后的半導體納米晶體與生物材料之間的靜電吸引作用可以實現對生物材料大腸桿菌麥芽糖結合蛋白的熒光標記-并可用作激光掃描成像、免疫分析的熒光探針, 是一種有效熒光示蹤工29具。半導體納米晶體與運鐵蛋白通過酰胺鍵連接后, 后者仍能保持其生物活性, 可以通過HeLa 細胞的細胞膜特異性地被細胞內的受體所識別。與人的免疫球蛋白抗原相連后, 標記抗原可保持其生物特331,32性并可特異性地識別多克隆抗體。張春陽等, 用雙光, 驗證了天花33粉蛋白能以受體介導的內吞方式進入人絨癌細胞的機理、588和620nm 的4, 用來觀(直徑40nm 進行對比。, 。在同樣的激發條件下, 前者比后者更亮, , 但是, 經過僅幾分鐘的連續照射, 會觀察T M , 與有機熒光標記化合物Cy3和T M Cy5作了比較。半導體納米晶體表面經過巰基琥珀酸處理與抗體連接, 可特異性地識別吸附在玻璃片上的抗原, 對抗原或抗體進行定性和半定量分析。在一塊蛋白芯片(7525mm 上, 用半導體納米晶體30可以同時進行兩種抗體或抗原的檢測。4. 4半導體納米晶體標記DNA 分子修飾半導體納米晶體與DNA 分子連接比修飾金納米顆粒與DNA 分子連接困難得多, 由于檸檬酸-金顆粒之間的相互作用比較弱, 巰基化的DNA 分子可以很容易地取代金顆粒表面的檸檬酸使其固定到金顆粒的表面。DNA 是帶有多個負電荷的親水大分子, 而合成的半導體納米晶體是親油性的, 半導體納米晶體與DNA 分子間的靜電作用使得兩者不可能連接。利用半導體晶體表面的原子如Zn 原子可28與巰基具有很強的絡合作用, 可以將DNA 修飾上巰基再與納米晶體進行連接。Mitchell 等將半導體納米晶體表面修飾上巰基丙酸, 然后用末端帶有巰基的DNA 分子部分取代巰基丙酸, 這樣使DNA 就可以連接到半導體納米晶體的表面。半導體納米晶體修飾的DNA 分子, 可作為寡核苷酸的熒光探針, 特異性地與其互補配對的寡核苷酸雜交。標記半導體納米晶體的DNA 分子與其互補配對的DNA 配對后納米晶體的熒光光譜會發生變化, 半導體納米晶體排列方式的改變是導致它們熒光變化的原因。有些34半導體納米晶體的熒光特性對環境的變化很敏感,Mahtab 等利用半導體納米晶體的這一特性來判定DNA 鏈是直的、彎曲的還是扭絞在一起的。隨著DNA 分子非線性程度的增加, 半導體納米晶體的熒光強度將不斷減小。這樣, 通過半導體納米晶體熒光強度的變化可判定同屬DNA 與蛋白之間的作用。35Han 等把可以發出不同光的半導體納米晶體封裝在一個聚合物微球中, 這樣, 每個球中的熒光種類可以不同, 各種大小的半導體納米晶體之間的數量比例也可以不同。用10種強度和6種顏色的納米晶體理論上可以提供10萬種不同的微球, 可為每種生物分子提供唯一的熒光信息。把DNA 序列連接到微球上, 根據微球中的半導體納米晶體的種類和它們間的熒光強度的比例, 唯一確定是哪種DNA 序列, 其準確度可達到99. 99%。在一個聚合物微球上, 對DNA 的雜交研究時可以同時獲得固定探針DNA 和游35離探針DNA 的熒光信息。5展望今后, 由于半導體納米晶體吸引人的發光性質, 將會用于藥物篩選、疾病篩查、基因測序等多個生命第9期 孫寶全等 : 半導體納米晶體的光致發光特性及在生物材料熒光標記中的應用 11 35 科學研究領域 ,有望會給這些領域帶來革命性的進步 。 36 37 生物芯片是目前的新興領域 ,對芯片上生物材料的檢測主要采用熒光標記檢測 。將半導體納 米晶體用于芯片上的生物標記后 ,由于發光強度增強 ,發射波峰尖銳 ,可改善芯片的靈敏度 ,有望會給生 物材料的檢測帶來突破性的進展 。對于一些背景熒光較強的芯片 ,由于半導體納米晶體的發光時間較 長 ,可采用時間分辨熒光進行檢測 。同時 ,采用非激光光源激發半導體納米晶體就可獲得足夠的熒光強 度用來檢測生物材料 ,降低了芯片的成本 。 References 1 Alivisatos A P. 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