X X X X大 學畢業設計說明書(論文)作 者:學 號：學院(系):專 業:生物工程題 目:芽孢桿菌XXXXXX抗稻瘟活性物質發酵條件的研究教授 指導者： (姓 名) (專業技術職務)評閱者： (姓 名) (專業技術職務) 2009年 6月畢業設計說明書（論文）中文摘要 本試驗以芽孢桿菌XXXXXX發酵液抑菌活性為主要指標,研究了發酵培養基中不同氮源營養因子,以及接種量、裝液量、初始pH、發酵時間、轉速、溫度等非營養因子對XXXXXX發酵液生物活性的影響。單因素試驗結果表明，XXXXXX菌最適宜的發酵條件是pH 為8、接種量體積分數2%、發酵溫度28、搖床轉速210r/min。不同的裝液量和發酵時間對XXXXXX發酵液的抗稻瘟活性并沒有影響。采用合成培養基，氮源為硝酸鈉時，XXXXXX菌的抗稻瘟活性優于其它氮源。正交試驗結果表明，菌株XXXXXX優化發酵培養基的最佳配方：可溶性淀粉質量分數為3%，硝酸鈉質量分數為0.25%，磷酸二氫鉀質量分數為0.1%，pH為7。關鍵詞 稻瘟菌 發酵條件 芽孢桿菌XXXXXX 正交設計畢業設計說明書（論文）外文摘要Title Effects of Culture Conditions on anti-Rice Blast fungus by Bacillus XXXXXX AbstractThe effects of the nutritional factors,inoculation rate,medium capacity, initial pH,fermentation time,rotate speed and fermentation temperature on biological activity of Bacillus XXXXXX were investigated by detecting the inhibition rate of rice blast fungus in the study.The result showed that the optimum fermentation conditions of XXXXXX included pH 8,inoculation rate 2%(v/v),fermentation temperature 28,rotate speed 210r/min.As to different fermentation time and medium capacity,the inhibitory effects of XXXXXX on rice blast fungus showed no different.When the nitrogen source was sodium nitrate,XXXXXX showed a stronger inhibitory ability than that the nitrogen source was yeast extract or peptone on synthetic medium. Orthogonal test showed that the optimum medium of XXXXXX fermentation was starch 3%,NaNO4 0.25%,KH2PO4 0.1%,pH 7.Keywords rice blast fungus; fermentation conditions; Bacillus XXXXXX; orthogonal design 本科畢業設計說明書（論文） 第 23 頁 共 28頁目 錄1 引言11.1 稻瘟菌概述11.2 生物農藥11.2.1 生物體農藥21.2.2 生物化學農藥21.2.3 生物農藥發展前景31.3 發酵工藝控制31.3.1 溫度對發酵的影響31.3.2 pH對發酵的影響41.3.3 接種量對發酵的影響41.3.4 轉速對發酵的影響41.3.5 發酵時間對發酵的影響41.3.6 裝液量對發酵的影響51.4 正交設計及其統計分析51.4.1 正交設計概述51.4.2 正交表及其特點51.5 本研究的目的及意義62 材料和方法62.1 材料62.1.1 菌種62.1.2 儀器設備62.1.3 試劑藥品72.1.4 培養基72.2 方法72.2.1 菌種保存72.2.2 菌種復活72.2.3土豆液制備72.2.4 種子液制備72.2.5 活性檢測72.2.6 單因素實驗確定發酵條件對活性的影響82.2.7 正交試驗確定最優培養基83 結果93.1 單因素實驗確定發酵條件對活性的影響93.1.1 pH對發酵液活性的影響93.1.2 溫度對發酵液活性的影響103.1.3 時間對發酵液活性的影響113.1.4 裝液量對發酵液活性的影響133.1.5 轉速對發酵液活性的影響143.1.6 接種量對發酵液活性的影響153.1.7 氮源對發酵液活性的影響163.2 正交設計確定最優化培養基18結 論20致 謝21參考文獻22表 1 培養基優化正交試驗方案8表 2 正交組合試驗結果18圖 1 不同pH條件下的抑菌圈9圖 2 pH對產生抗生素的影響10圖 3 不同溫度條件下的抑菌圈11圖 4 溫度對產生抗生素的影響11圖 5 不同發酵時間的抑菌圈12圖 6 發酵時間對產生抗生素的影響12圖 7 不同裝液量條件下的抑菌圈13圖 8 裝液量對產生抗生素的影響13圖 9 不同轉速條件下的抑菌圈14圖 10 轉速對產生抗生素的影響15圖 11 不同接種量條件下的抑菌圈15圖 12 接種量對產生抗生素的影響16圖 13 不同氮源條件下的抑菌圈17圖 14 氮源對產生抗生素的影響17圖 15 四因素與NUST菌株產抗的關系191 引言1.1 稻瘟菌概述水稻稻瘟病(Blast Fungus)，是全世界稻區危害最嚴重的水稻病害之一，義名稻熱病，俗稱火燒瘟、吊頭瘟、掐頸瘟等，由稻梨孢菌（PyiculariaoryzaeCav.）引起。該病一年四季均可對水稻造成危害，其危害遍及水稻的各個部位，有苗稻瘟、葉瘟、葉枕瘟、節稻瘟、穗頸瘟、枝梗瘟和谷粒瘟等1。稻瘟病菌主要在稻草上和稻種上越冬，菌絲發育的溫度為837攝氏度，以2428攝氏度最適合；分生孢子在1035攝氏度之間都可形成和發芽，經過46天便發育長大。分生孢子很輕，以空氣為主要傳播途徑，一落到水稻上，只要得到一點水份都可成活，鉆到水稻體內，便會破壞細胞，吸收養份。它鉆入的地方，便可看到病斑，病斑再產生分生孢子，又傳播到其它植株上，危害其它的植株。水稻在分蘗期和孕穗期抵抗力差，極易被感染。它的生長由天氣、肥水管理、品種的抗性三大因素構成。從天氣上講，溫度在2030度，相對溫度在80%90%最適合病菌孢子發育和傳播；肥水管理上講，肥水管理也很密切，如偏施氨肥或肥料用量過大、施肥的時間等形成稻瘟病菌生長的有利條件。美國科學家在2005年4月21日出版的自然雜志上公布了常見的稻瘟病菌的基因組草圖，這是科學家首次完成植物病原體的基因測序。美國北卡羅來納州立大學科學家報告說，測序結果表明稻瘟病菌的基因超過1.1萬個。另外，他們發現這種真菌的孢子上存在一個受體，這種受體能夠區別水稻和其他作物。科學家說，該受體的發現在抗擊這種病菌的道路上邁出了一大步。科學家可以通過轉基因方法對水稻進行改良，使其不被受體識別。水稻稻瘟病的研究已有100余年的歷史，我國早在1925年就開始調查研究，70余年來，在水稻種質資源的抗性鑒定、篩選和利用，抗瘟良種的選育、病菌生理小種、預測預報和綜合防治等方面取得了顯著的進展2。但由于品種的更替，氣候的變化，栽培耕作制度的改革，以及病菌小種組成的變化等因素的綜合影響，稻瘟病的發生和危害仍然是當今世界各稻區面臨的難題，抗病良種在推廣35年后，病菌常產生能侵染該品種的優勢小種，從而引起抗性喪失。隨著品種的單一化和品種抗性的“喪失”，往往出現流行，造成嚴重損失。1.2 生物農藥生物農藥是“可用來防治病、蟲、草等有害生物的生物體本身及源于生物，并可作為農藥的各種生理活性物質”。按上述定義，生物農藥應包括生物體農藥和生物化學農藥。生物體農藥是指用來防除病、蟲、草等有害生物的商品活體生物，生物化學農藥則是指從生物體中分離出的具有一定化學結構，對有害生物有控制作用的生物活性物質3。1.2.1 生物體農藥生物體農藥包括植物體農藥、動物體農藥和微生物體農藥3大類。1.2.1.1植物體農藥4植物體農藥是利用作物本身為載體，經基因修飾或重組而開發為農藥。1983年第一株轉基因植物問世，1986年美國EPA 首次批準孟山都公司的轉基因作物如抗蟲棉、大豆和抗草甘膦玉米進行試驗,1994年準許其商品化生產，并首次將之列入農藥范疇。1.2.1.2動物體農藥動物體農藥主要是指商品化的天敵昆蟲和捕食螨，以及采用物理或生物技術改造的昆蟲等。在早期的生物防治中，最重要的措施就是利用天敵昆蟲和捕食螨。捕食性天敵分屬于8個目的200個科內，常用的種類有瓢蟲、草蛉、胡蜂等。1.2.1.3微生物體農藥微生物體農藥是指用來防治有害生物的活體微生物。細菌類農藥制劑有Bt(蘇云金桿菌)、亞寶(枯草桿菌)、力寶(假單胞桿菌)、增產菌(蠟狀芽孢桿菌)等。近年來，采用基因工程等高新技術獲得了Bt工程菌株，其毒力水平較出發菌株提高了1.54.3倍口，部分指標達到國際先進水平。一些害蟲對Bt產生了抗藥性，為了延緩其抗藥性的產生，應用Bt制劑與阿維菌素、昆蟲生長調節劑等復合增效的方式，成功研制了Bt生物復合殺蟲劑抑蟲啉和克蟲威，其殺蟲效果良好，使用成本大大降低。1.2.2 生物化學農藥生物化學農藥包括植物性生物化學農藥、動物性生物化學農藥和微生物性生物化學農藥3大類6。1.2.2.1 植物性生物化學農藥自20世紀80年代以來，植物性生化農藥在我國發展很快，至今已成功地開發出了許多植物性農藥，煙堿等16種植物性農藥已登記注冊，生產企業達46家。植物性殺蟲劑主要是利用植物體內的次生代謝物質如生物堿、萜烯類、黃酮等來抑制害蟲的生長發育，干擾其正常行為。研究的內容涉及到楝科、禾本科、衛矛科、柏科、豆科、菊科、瑞香科等科的多種植物6。1.2.2.2 動物性生物化學農藥動物性生化農藥中最常見的為昆蟲性信息素類。據統計，全世界現已合成昆蟲性信息素l000多種，已商品化的有280多種。同時，對蚜蟲的報警信息素、蜚蠊的聚集信息素和螞蟻的蹤跡信息素進行了研究，并取得了較大的成果。1.2.2.3 微生物性生物化學農藥微生物產生的抗生素和毒素如Avermectin、井岡霉素、雙丙氨磷、赤霉素、梅嶺霉素等可防治多種病、蟲、草、螨，效果很好。1987年Barron等報道了一種真菌粗皮側耳菌絲產生的毒素可擊倒線蟲，1992年從粗皮側耳中分離出一種殺線蟲毒素transzecenedioic acid7。至今已發現9O余種殺線蟲的真菌毒素，如擔子菌、子囊菌及其活性代謝物。梅嶺霉素對蘋果紅蜘蛛、柑橘紅蜘蛛、二斑葉螨有很好防效。1.2.3 生物農藥發展前景對我國來說，微生物性農藥和植物性農藥是生物農藥發展的主體。當前，微生物農藥特別是Bt發展得到了大力扶持，Bt資源豐富，產品工業化生產便捷，與多種生物農藥復合增效能力極強，并已開發出用于防治農作物(蔬菜、水稻、棉花等)、森林(含城市園林)和公共衛生等方面主要害蟲的系列產品，其殺蟲潛力在蔬菜、水稻、棉花及經濟林果主要害蟲上逐漸得到發揮。因此，以Bt為依托研制開發新型高效、低毒、低成本殺蟲劑是一條徹底改變我國現存殺蟲劑品種布局不合理的捷徑，也是短、平、快開發國產農藥品種并與國外農藥競爭的重要手段8。1.3 發酵工藝控制微生物發酵的生產水平不僅取決于生產菌種本身的性能，而且要賦以合適的環境條件才能使它的生產能力充分發揮出來。為此，我們必須通過各種方法了解有關生產菌種對環境因素的要求，如培養基、培養溫度、pH、氧的需求等，并深入了解生產菌在合成產物過程中的代謝調控機制以及可能的代謝途徑，為設計合理的生產工藝提供理論基礎9。就產品的類型而言，發酵有下列幾種主要類型10：以微生物菌體為產物的微生物菌體發酵、以微生物酶（含蛋白）為產物的酶發酵、以菌體代謝產物（含初級代謝產物和次級代謝產物）為目的的產品發酵和利用微生物酶修飾作用的微生物轉化發酵等。1.3.1 溫度對發酵的影響微生物能夠在一個較寬的溫度范圍內生長，但是要獲得高質量的發酵液，其最適溫度區間很狹窄。溫度的變化對發酵過程可產生兩方面的影響：一方面是影響各種酶反應的速率和蛋白質的性質；另一方面是影響發酵液的物理性質11。產物的合成是由一系列的酶催化反應來完成的。一般發酵溫度升高，酶反應速率增大，發酵周期縮短。但酶本身又很容易過熱而失活，從而影響酶催化效率，最終降低產率。因此發酵產物的合成也有一個最適溫度。另外，溫度還會影響生物合成的方向。例如，四環素發酵中金色鏈霉菌同時能產生金霉素，在低于30下，合成金霉素的能力較強。合成四環素的比例隨溫度的升高而增大，在35下只產生四環素。近年來研究發現，溫度對代謝有調節作用。在低于20時，氨基酸合成途徑終產物對第一個酶的反饋抑制作用比在正常生長溫度37大。1.3.2 pH對發酵的影響發酵培養基的pH值，對微生物的生長具有非常明顯的影響，也是影響發酵過程中各種酶活動的重要因素。由于pH不當，可能嚴重影響菌體的生長和產物的合成，因此對微生物發酵來說有各自的最適生長pH。生長在高pH（8.5-11.5）的微生物稱為嗜堿菌；嗜酸菌是指那些生長在低pH（0-5.5）中的微生物12。1.3.3 接種量對發酵的影響這是指移種的種子液體積與發酵液體積之比。不同微生物其發酵的接種量是不同的。接種量的大小是由該菌種在發酵過程中的生長繁殖速度決定的。通常，采用較大的接種量可以縮短生長達到高峰的時間，是產物的合成提前。這是由于種子量多，種子液中含有大量的胞外水解酶類，有利于基質的利用，并且生產菌在整個發酵罐內迅速占優勢，從而減少雜菌生長的機會。但是，接種量過大，也可能使菌種生長過快、培養液黏度增加，導致溶氧不足，影響產物合成13。1.3.4 轉速對發酵的影響在需氧發酵過程中，氣態氧必需先溶解于培養液中，然后才可能傳遞到細胞表面，再經過簡單的擴散作用進入細胞內，參與菌體內的氧化等生物化學反應。因此，實驗室三角瓶發酵需要在搖床上進行。控制轉速對于發酵來說至關重要，轉速太小，氧氣無法進入發酵液中；轉速太快，分子氧無法與菌體充分接觸。1.3.5 發酵時間對發酵的影響當一個細菌的細胞接種于含有生長所需基本成分的培養基時。細胞開始累積營養物，合成新的細胞結構成分，細胞長大，復制它的遺傳物質，最后合成新的細胞壁和細胞分，一個細胞分裂變成兩個細胞，經過另外一段時間分裂變成四個細胞。細菌在液體培養基中遵循典型模式規律生長，細菌接種后立即有一個適應培養基的階段稱為延遲期，接著就是對數生長期，以活細胞數目的對數對時間所作曲線，可以見到一小段直線，一旦營養耗盡或有毒代謝物積累，細胞數目的凈增長停止，稱作穩定期，再經過一段時間之后，緊接著是衰亡期，細胞數目下降，直到細胞裂解18。因此，發酵過程一定要在對數期即將結束的時候就停止。1.3.6 裝液量對發酵的影響裝液量的多少主要是影響發酵瓶內空氣量的多少。依據細菌的代謝類型，它們對氧氣的要求變化很大。好氧菌為在有分子氧條件下才能生長的細菌；厭氧菌為生長不需要氧的細菌；在此范圍內還有專性厭氧菌在有氧條件下致死。兼性厭氧菌如大腸桿菌，有氧情況下生長的更好，無氧條件下也能生長。1.4 正交設計及其統計分析1.4.1 正交設計概述正交設計(orthogonal design)是一種研究多因素試驗的設計方法。在多因素試驗中，隨著試驗因素和水平數的增加，處理組合數急劇增加。例如，3因素3水平的試驗，就有33=27個處理組合，4因素4水平的試驗，就有44=256個處理組合。要全面實施這么龐大的試驗室相當困難的。因而，D.J.Finney 倡議了部分試驗法。而后日本學者倡導利用征繳款式設計部分試驗，稱為正交試驗14。正交試驗利用一套規格化的表格正交表（orthogonal table）來科學合理地安排試驗的設計方法。這種設計的特點是在全部試驗處理組合中，挑選部分有代表性的水平組合（處理組合）進行試驗。通過部分實施了解全面試驗情況，從中找出較優的處理組合。這樣可以大大節省人、財、物和時間，使一些難以實施的多因素試驗得以實施。例如，要進行一個4因素3水平的多因素試驗，如果全面實施則需要34=81個處理組合，在試驗中因規模太大而難以實施。但是，如果采用一張L9（34）的正交表安排試驗，則只要9個處理組合就夠了。1.4.2 正交表及其特點正交表是正交設計的基本工具。在正交設計中，安排試驗、分析結果，均在正交表上進行。常用的正交表，已由數學工作者制定出來，試驗時只要根據實驗條件直接套用就行了，不需要另行編制15。用正交表進行試驗安排具有以下兩個特性：（1）均衡分散性：是說明正交表挑出來的這部分水平組合，在全部可能的水平組合中分布均勻，因此代表性強，能較好地反映全面情況。（2）整齊可比性：由于正交表中個因素的水平是兩兩正交的，因此任一因素任一水平下都必須均衡的包含著其它因素的個水平。常用正交表中，適用于二水平試驗的L4（23）、L8（27），適用于三水平試驗的有L9（34）、L27（313）等，還有適用于四水平、五水平及水平數不等的正交表，共設計時選用。1.5 本研究的目的及意義本實驗室通過平板對峙法從土壤中分離出對水稻稻瘟病菌有拮抗作用的枯草芽孢桿菌XXXXXX。通過初步的研究發現，該菌對水稻稻瘟菌具有明顯的抑制作用。本課題擬分析影響XXXXXX的發酵因素，研究不同條件對該菌代謝產物活性的影響，為開發抗稻瘟制劑確定最適的培養基。2 材料和方法2.1 材料2.1.1 菌種XXXXXX是本實驗室保存菌種；水稻稻瘟菌（Blast Fungus）是本實驗室保存菌種。2.1.2 儀器設備恒溫振蕩器 太倉市科技器材廠電子萬用爐 天津泰斯特儀器廠電子天平 上海良年儀器儀表有限公司立式壓力蒸汽滅菌器 上海博訊實業有限公司醫療設備廠 特制加厚鋁鍋 淮南市大通區泰達鋁制品廠雙人單面凈化工作臺 蘇州凈化設備有限公司隔水式恒溫培養箱 上海博訊實業有限公司醫療設備廠全溫度光照震蕩培養箱 太倉市華美生化儀器廠高速微量離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司玻璃儀器烘干器 河南省鞏義市英峪予華儀器廠2.1.3 試劑藥品無水氯化鈣，蔗糖，酵母膏，磷酸二氫鉀，氯化亞鐵，硫酸鎂，硝酸鈉，可溶性淀粉，蛋白胨，瓊脂。2.1.4 培養基PDA培養基：蔗糖2.0%，土豆20%，瓊脂 1.2%。種子培養基：蔗糖 2.0%，土豆 20%。發酵培養基：土豆 20%。Ht培養基：磷酸二氫鉀 0.1%，無水氯化鈣 0.01%，硫酸鎂 0.015%，氯化鐵 0.001%，可溶性淀粉 3%，硝酸鈉 0.25%，水50mL。2.2 方法2.2.1 菌種保存采用20%甘油保存菌種，即甘油:菌液=20:80,800uL菌液加200uL滅菌甘油后,充分混勻后,-70保藏。2.2.2 菌種復活將保存的XXXXXX菌株，用接種環接入含有PDA培養基的培養皿中，28下培養24d。2.2.3土豆液制備將新鮮土豆去皮，稱重，切成薄片，水煮加熱，待沸騰之后保持微沸狀態30min，冷卻，用雙層濾布過濾，并按照5：1的比例定容。2.2.4 種子液制備將活化好的菌種接種到種子液培養基中，在28、180r/min條件下振蕩培養18h。2.2.5 活性檢測發酵液經0. 45m微孔濾膜過濾滅菌后，取3mL過濾液與30mL冷卻至55左右的PDA培養基混合倒入已滅菌培養皿中，待凝固后，在培養基中央接種生長旺盛的稻瘟病菌進行拮抗性測定, 以無菌空白培養基作對照，28下培養57d。測量菌落直徑, 并計算相對抑菌率。相對抑菌率(%)=(對照菌落半徑-處理菌落半徑)/對照菌落半徑100%或相對抑菌率(%)=拮抗帶寬度/對照菌落半徑100%2.2.6 單因素實驗確定發酵條件對活性的影響2.2.6.1 pH對發酵液活性的影響16在其他培養條件一致的條件下，將培養基的起始pH值分別調至2、4、6、8、10、12、14，28、180r/min恒溫搖床培養30h，測定發酵液活性。2.2.6.2 溫度對發酵液活性的影響按2%接種量接種，分別在28、37下180 r/min振蕩培養30h，測定發酵液活性。2.2.6.3 時間對發酵液活性的影響17將培養好的種子液，按2%接種于發酵培養基中，在28、180 r/min恒溫搖床中分別培養12h、24h、36h、48h、72h、96h，測定發酵液活性。2.2.6.4 裝液量對發酵液活性的影響18以搖瓶裝液量變化方式來進行,在250mL三角瓶中加入發酵培養基分別為25mL、50mL、75mL、100mL、125mL和150mL, 按2%接種種子液于發酵培養基中，在28、180 r/min條件下培養30h,測定發酵液的抗稻瘟活性。2.2.6.5 轉速對發酵液活性的影響19按2%接種量接種,分別在28，210r/min、100r/min轉速下振蕩培養30h,測定發酵液活性。2.2.6.6 接種量對發酵液活性的影響20分別采用裝液量的1 %、2 %、5 %、7.5 %、10%、20%的接種量接種拮抗菌株XXXXXX于液體發酵培養基中, 28、180r/min恒溫搖床培養30h,測定發酵液活性。2.2.6.7 氮源對發酵液活性的影響21在Ht培養基中分別添加1%的硝酸鈉、酵母膏、蛋白胨作為氮源，接種后28、180r/min恒溫搖床培養30h,測定發酵液活性。2.2.7 正交試驗確定最優培養基選取可溶性淀粉、硝酸鈉、磷酸二氫鉀、pH為主要發酵條件, 設計四因素三水平正交試驗, 見表2。配制培養基, 按不同發酵條件發酵培養后,測定各發酵液對稻瘟病菌的拮抗性22-24。表 1 培養基優化正交試驗方案試驗號（處理組合）1列：可溶性淀粉（A）2列：硝酸鈉（B）3列：磷酸二氫鉀（C）4列：pH（D）1234567891：0.5g1：0.5g1：0.5g2：1.5g2：1.5g2：1.5g3：2.5g3：2.5g3：2.5g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.125g3：0.25g1：02：0.05g3：0.1g2：0.05g3：0.1g1：03：0.1g1：02：0.05g1：42：73：103：101：42：72：73：101：43 結果3.1 單因素實驗確定發酵條件對活性的影響3.1.1 pH對發酵液活性的影響對在不同pH條件下測定發酵液活性試驗所得到的平板拍照如圖1所示，測量稻瘟菌的生長直徑并繪制成圖如圖2所示。圖 1 不同pH條件下的抑菌圈注：a-2；b-4；c-6；d-8；e-10；f-12；g-14；h-對照圖 2 pH對產生抗生素的影響結果表明發酵液pH 值對拮抗菌株XXXXXX產生抗稻瘟物質的抑菌活性關系密切,發酵液初始pH在8時代謝產物的活性最強；在微酸性或微堿性的環境中，發酵液對稻瘟菌的抑制作用較強；但是在過酸性（pH12）的環境中活性受到明顯的抑制。3.1.2 溫度對發酵液活性的影響對在不同溫度發酵條件下測定發酵液活性試驗所得到的平板拍照如圖3所示，測量稻瘟菌的生長直徑并繪制成圖如圖4所示。圖 3 不同溫度條件下的抑菌圈注：a-37；b-28；c-對照圖 4 溫度對產生抗生素的影響觀察發現，XXXXXX菌在28條件下培養得到的發酵液活性大于在37得到的發酵液。相對于對照組，28的發酵液的抑菌率為17%，而37的發酵液幾乎沒有活性。3.1.3 時間對發酵液活性的影響對在不同發酵時間條件下測定發酵液活性試驗所得到的平板拍照如圖5所示，測量稻瘟菌的生長直徑并繪制成圖如圖6所示。圖 5 不同發酵時間的抑菌圈注：a-12h；b-24h；c-36h；d-48h；e-72h；f-96h；g-對照圖 6 發酵時間對產生抗生素的影響研究發現，發酵時間的長短對XXXXXX菌發酵液的活性沒有明顯的影響。3.1.4 裝液量對發酵液活性的影響對在不同裝液量條件下測定發酵液活性試驗所得到的平板拍照如圖7所示，測量稻瘟菌的生長直徑并繪制成圖如圖8所示。 圖 7 不同裝液量條件下的抑菌圈注：a-25mL；b-50mL；c-75mL；d-100mL；e-125mL；f-150mL；g-對照 圖 8 裝液量對產生抗生素的影響研究發現，小于75mL 裝液量的發酵液的活性強于大于100mL裝液量，但是，差異并不顯著。3.1.5 轉速對發酵液活性的影響對在不同轉速發酵條件下測定發酵液活性試驗所得到的平板拍照如圖9所示，測量稻瘟菌的生長直徑并繪制成圖如圖10所示。 圖 9 不同轉速條件下的抑菌圈注：a-210r/min；b-100r/min；c-對照 圖 10 轉速對產生抗生素的影響觀察發現，XXXXXX菌在不同的轉速條件下培養得到的發酵液的活性具有明顯的差異，在轉速為210r/min的發酵液活性大于在100r/min轉速下得到的發酵液。相對于對照組，210r/min轉速下發酵液的抑菌率達到40%；而在100r/min的轉速下，發酵液抑菌率僅為14%。3.1.6 接種量對發酵液活性的影響對在不同接種量條件下測定發酵液活性試驗所得到的平板拍照如圖11所示，測量稻瘟菌的生長直徑并繪制成圖如圖12所示。 圖 11 不同接種量條件下的抑菌圈注：a-1%；b-2%；c-5%；d-7.5%；e-10%；f-20%；g-對照圖 12 接種量對產生抗生素的影響結果顯示，在接種量為2%時，發酵液的活性最強，其活性是10%接種量條件下的5倍左右。從整體上看，較小接種量條件下的發酵液活性普遍高于較大的接種量，說明在接種量過高時，由于培養基內菌體量過大，營養物質消耗過快，導致菌類大量死亡，產物的合成量大大減少。3.1.7 氮源對發酵液活性的影響對在不同氮源條件下測定發酵液活性試驗所得到的平板拍照如圖13所示，測量稻瘟菌的生長直徑并繪制成圖如圖14所示。 圖 13 不同氮源條件下的抑菌圈注：a-硝酸鈉；b-蛋白胨；c-酵母膏；d-對照 圖 14 氮源對產生抗生素的影響觀察發現，不同的氮源發酵得到的發酵液活性從高到低依次為：硝酸鈉、蛋白胨、酵母膏，三者的差異明顯。對于芽孢桿菌XXXXXX菌來說，相較于有機氮源來說，無機氮源更有利于該菌的生長和產物的合成，其對無機氮源的利用率也更高。3.2 正交設計確定最優化培養基正交試驗結果如表2和圖15所示。表 2 正交組合試驗結果No.ABCD直徑/mm抑菌率/%12345678911122233312312312312323131212331223123132617221517181633.356.713.343.326.75043.34046.7T1T2T370.0113.3110090.0106.796.7100.0123.370.063.3133.396.7X1X2X323.337.836.730.035.632.233.341.123.321.144.432.2R14.45.617.823.3 圖 15 四因素與NUST菌株產抗的關系由極差分析可以得出，以因素D對XXXXXX產抗稻瘟活性物質的影響最為顯著，因素C、A次之，因素B最小。所以，pH為最重要因素，其次是磷酸二氫鉀、然后是可溶性淀粉、硝酸鈉為最不重要因素。各因素實驗指標的影響因素作用按大小排序為:DCAB。理論優化方案為:A2B2C2D2。即可溶性淀粉質量分數為3%，硝酸鈉質量分數為0.25%，磷酸二氫鉀質量分數為0.1%，pH為7。結 論本實驗室通過在不同的條件下培養XXXXXX菌，并測定其發酵液的抗稻瘟菌活性來評價其抑菌能力。根據單因素試驗分析，不同的pH、轉速、溫度、接種量和氮源均能夠不同程度的影響XXXXXX菌的生長。XXXXXX菌在發酵液的pH為8、接種量按照2%接種在28、210r/min的條件下生長情況較佳；相反，對于不同的裝液量和發酵時間，XXXXXX菌均能夠正常生長。采用合成培養基，氮源為硝酸鈉時，XXXXXX菌的生長狀況由于在其它氮源情況下。依據正交試驗結果顯示，理論的優化方案為: A2B2C2D2，即可溶性淀粉質量分數為3%，硝酸鈉質量分數為0.25%，磷酸二氫鉀質量分數為0.1%，pH為7。致 謝值此論文完成之際，要感謝在本科階段給予我指導、幫助和關心的所有人。論文是在導師X教授的悉心指導和嚴格要求下完成的，從論文的選題、方案的確定與實施、以至實驗的進行、論文的構思與撰寫，無不傾注導師的心血與汗水。他求實創新的科研精神、嚴謹治學的科學態度、高尚的道德情操、誨人不倦的師長風范使我在學習和生活中受益匪淺，特別是他對學生嚴格要求認真負責的態度、對科研一絲不茍實事求是的精神、對工作勤奮執著兢兢業業的精神令我終身難忘。值此論文付梓之際，謹向X老師致以最崇高的敬意！在校學習及實驗期間還得到了眾多老師的指導和幫助，特向X老師、X老師、X老師、X老師等表示誠摯的謝意！特別感謝本實驗室X博士和分子代謝中心諸位學長、學姐給予我的指導和幫助！感謝父母給予我的學習生活上無微不至的關懷鼓勵、支持和幫助。他們對于我的關心、理解是我不斷前進的動力。 再次向所有指導、關心、幫助和支持我的老師、同學、朋友、親人致以最衷心的謝意!參考文獻1 張宇，張敏，葉亞軍.稻瘟病生防放線菌菌株A11發酵液中抗菌物質的穩定性測定J.中國農學通報，2005，21(6)：315316.2 孫國昌，杜新法，陶榮祥等.水稻稻瘟病防治研究進展和2l世紀初研究設想J.植物保護，2000，26(1)：33353 張寧波.農用抗生素研究進展J.湖北農業科學，2006，45(6)：830833.4 胡慶堂微生物農藥生產技術進展J生物工程進展，199